长芒苋谷氧还蛋白基因家族的鉴定及其在非生物胁迫响应中的功能解析

《Plant Physiology and Biochemistry》：Identification and analysis of glutaredoxin genes in Amaranthus palmeri reveal roles in abiotic stress responses

　　

： 在入侵性杂草长芒苋（Amaranthus palmeri）中鉴定出12个ApGRX基因。ApGRX基因受NaCl、干旱、H2O2和草铵膦（glufosinate ammonium）诱导表达。ApGRX2和ApGRX3定位于质膜并减少活性氧（ROS）积累。过表达ApGRX2和ApGRX3可增强过氧化氢酶（CAT）活性并降低丙二醛（MDA）含量。表达ApGRX2或ApGRX3的酵母对盐胁迫和渗透胁迫表现出更高的耐受性。

一、研究背景与科学问题

谷氧还蛋白（glutaredoxin，GRX）是一类广泛存在于植物中的小型氧化还原酶，以谷胱甘肽（glutathione，GSH）为电子供体催化靶蛋白二硫键的还原，在维持细胞氧化还原稳态、清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）、调控转录因子活性及铁硫簇组装等生物学过程中发挥关键作用。已有研究表明，GRX基因家族在拟南芥、水稻、番茄、大豆等多种模式植物和作物中已被系统鉴定，并证实其参与植物对盐碱、干旱、氧化胁迫及除草剂胁迫的适应性响应。

长芒苋（Amaranthus palmeri S. Watson）是一种起源于墨西哥西北部和美国西南部的雌雄异株一年生杂草，目前已扩散至原生境以外广大区域，被公认为现代农业生态系统中最具破坏性的杂草之一。该杂草具有萌发期长、营养生长迅速、资源竞争能力强等特性，长期共存可导致玉米、棉花和大豆等主要作物产量显著下降。目前已在长芒苋中报道了对九类作用机制的除草剂产生抗性。然而，尽管长芒苋在农学和生态学领域受到广泛关注，其突出的逆境适应性和入侵能力的分子基础仍不清楚，特别是其抗氧化及氧化还原调控相关的机制研究尚不充分。

基于此，研究人员开展了长芒苋GRX基因家族的全基因组鉴定与功能分析，旨在揭示该杂草逆境适应性的分子机制，为其入侵扩散能力提供理论解释，并筛选可用于作物抗逆改良的候选基因资源。

二、研究内容与主要结论

该研究从长芒苋基因组中鉴定出12个非冗余的ApGRX蛋白，分布于8条scaffold上，其中Scaffold-2和Scaffold-4包含最多旁系同源基因。基于7个植物物种共81条GRX氨基酸序列构建的最大似然系统发育树将所有序列分为三个进化枝，12个ApGRX蛋白仅分布于Clade I和Clade II，而拟南芥GRX蛋白占据全部三个亚组。保守基序扫描显示Clade II蛋白普遍包含全部8个保守基序，Clade I成员额外共享Motif 1、2、5和6。

理化性质分析显示，ApGRX蛋白氨基酸长度介于102至449个残基之间，等电点范围为5.33至9.31，分子量介于11.09 kDa至49.03 kDa之间。根据不稳定指数评估，5个ApGRX蛋白结构稳定，其余7个不稳定。GRAVY指数显示家族内亲水性蛋白与疏水性蛋白各占6个。信号肽预测仅发现ApGRX8携带典型信号肽。二级结构分析表明无规卷曲和α-螺旋构成主要结构组分，分别占总结构的32.35%-65.54%和21.28%-49.67%。三级结构同源建模显示ApGRX2、ApGRX4、ApGRX5和ApGRX6具有复杂的三维折叠结构，其余蛋白呈现相对松散无序的空间构象。miRNA靶标预测鉴定出5个miRNA可能调控3个ApGRX基因的转录后表达，其中ApGRX2与3个miRNA成员存在互作。

基因结构分析显示ApGRX基因外显子数目为1至5个不等，内含子数目为0至4个，表明该家族存在显著的结构多样性。保守基序预测共鉴定出12个保守蛋白基序，Motif 1存在于所有ApGRX蛋白中，Motif 10和12仅分布于ApGRX7，Motif 11特异性存在于ApGRX12，Motif 5仅由ApGRX5和ApGRX7共享。启动子区2 kb上游序列分析鉴定出丰富的顺式作用元件，涵盖代谢调控、转录调控、植物激素信号转导、生长发育及胁迫响应等功能类别，包括干旱诱导、光响应、ABA和SA信号通路、低温耐受、分生组织发育及种子特异性调控元件。

RT-qPCR表达分析显示，干旱处理下ApGRX3表达在12 h达到峰值，ApGRX6在12至24 h维持高转录水平，而ApGRX11和ApGRX12持续受抑制。盐处理下ApGRX2、ApGRX3和ApGRX6被激活并在24 h达到最大值。H₂O₂处理上调3个ApGRX基因，表达在12至24 h达到峰值。草铵膦处理持续诱导ApGRX2表达，在72 h达到最高转录丰度，而ApGRX3、ApGRX11和ApGRX12在整个处理期间保持受抑制状态。

亚细胞定位实验通过在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中的瞬时表达证实ApGRX2和ApGRX3特异性定位于质膜，与质膜标记物mCherry-AtREM1.3共定位，且绿色荧光信号不与叶绿体红色自发荧光重叠。

生理实验表明，在渗透胁迫、NaCl、H₂O₂和草铵膦处理下，瞬时过表达ApGRX2和ApGRX3的烟草叶片较GFP对照表现出更低的MDA含量和更高的CAT及超氧化物歧化酶（SOD）活性。DAB和NBT组织化学染色进一步证实转基因叶片中H₂O₂和超氧阴离子积累显著减少。

酵母异源表达实验表明，在NaCl（0.2-0.8 M）和山梨醇（1.0-1.6 M）胁迫条件下，表达ApGRX2或ApGRX3的酵母细胞较空载体对照表现出更好的生长活力和更高的存活率。

三、主要技术方法

该研究采用的主要技术方法包括：基于隐马尔可夫模型（HMM）和BLASTP同源搜索的全基因组GRX基因鉴定；ProtParam、SignalP 5.0、SOPMA和SWISS-MODEL等生物信息学工具进行蛋白理化性质、信号肽、二级结构和三维结构预测；MEGA 11构建最大似然系统发育树；MEME套件进行保守基序鉴定；PlantCARE数据库进行启动子顺式元件分析；psRNATarget进行miRNA靶标预测；RT-qPCR进行基因表达分析；农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达结合激光荧光显微镜进行亚细胞定位验证；DAB和NBT组织化学染色及商业试剂盒进行生理指标测定；酵母异源表达系统进行胁迫耐受性验证。

四、讨论与结论

讨论部分指出，与多数模式植物和作物拥有扩张的GRX基因家族不同，长芒苋仅含有相对精简的12个GRX成员，提示可能存在谱系特异的基因收缩事件，这与苋科物种氧化还原代谢相关基因家族普遍收缩的报道一致。系统发育分类将ApGRX蛋白分为三个保守亚组，对应植物中广泛保守的CC型、CPYC型和CGFS型GRX，其中CPYC型主要参与硫醇-二硫键交换和抗氧化防御反应，CGFS型主导铁硫簇组装和氧化还原信号传递。大多数ApGRX基因具有紧凑的外显子-内含子结构，有利于环境胁迫下的快速转录激活。启动子中丰富的胁迫响应和激素信号相关顺式元件表明长芒苋可能通过整合激素和环境信号动态调节细胞内氧化还原状态。ApGRX2、ApGRX3和ApGRX6在盐、干旱和氧化胁迫下显著诱导，符合植物GRX典型的抗氧化和渗透调节功能；而ApGRX11和ApGRX12在多数胁迫条件下持续下调，可能属于胁迫诱导的基因表达重编程的一部分而非主动参与抗逆。ApGRX2和ApGRX3的质膜定位使其能够直接感知胞外胁迫信号并快速调整细胞氧化还原状态。研究人员强调，所有功能实验均在异源系统（烟草叶片和酵母细胞）中完成，缺乏长芒苋天然的信号通路和互作网络，观察到的抗氧化表型可能无法完全反映这两个基因在长芒苋中的内源功能，未来需在长芒苋中建立稳定转基因或基因编辑体系加以验证。

研究结论为：该研究在长芒苋中鉴定并表征了12个GRX蛋白。系统发育和启动子分析表明ApGRX蛋白可能参与多种非生物胁迫响应。表达分析显示ApGRX2、ApGRX3和ApGRX6受NaCl、干旱、H₂O₂和草铵膦的转录上调，而ApGRX11和ApGRX12基本受抑制，表明家族成员间存在功能分化。亚细胞定位研究证实ApGRX2和ApGRX3与质膜相关。在本氏烟中过表达这两个基因导致CAT活性升高、MDA积累减少并在胁迫条件下降低ROS积累，而在酵母中表达则增强了对渗透和盐处理的耐受性。这些结果为理解长芒苋中GRX介导的氧化还原调控提供了框架，并鉴定出值得进一步功能表征的候选基因。