《Plant Stress》：Thermosensitive OsPPR14-OsMORF interactions contribute to chloroplast RNA editing and splicing under high temperature in rice
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虽然五肽重复（pentatricopeptide repeat, PPR）蛋白对于叶绿体基因表达不可或缺，但它们如何在高温胁迫下参与叶绿体RNA加工在很大程度上仍属未知。本研究证实，水稻P型PPR蛋白OsPPR14是维持叶绿体RNA编辑与剪接准确性所必需的
虽然五肽重复（pentatricopeptide repeat, PPR）蛋白对于叶绿体基因表达不可或缺，但它们如何在高温胁迫下参与叶绿体RNA加工在很大程度上仍属未知。本研究证实，水稻P型PPR蛋白OsPPR14是维持叶绿体RNA编辑与剪接准确性所必需的，尤其在高温条件下尤为关键。功能缺失的osppr14突变体表现出显著的热敏性白化表型：突变体幼苗在28°C下保持绿色但生长迟缓，而在35°C下则出现严重白化、叶绿素含量降低以及叶绿体超微结构破坏。RNA加工分析显示，在osppr14突变体中，35°C加剧了28°C下已存在的atpF和ndhA剪接缺陷，进一步导致matK-1258、ndhA-473、ndhA-1070、ndhB-737、rpl2-2和rps14-80位点的RNA编辑缺陷，同时损害ndhB、rpl2、rps12、rps16和ycf3中额外的剪接事件。此外，OsPPR14与多个OsMORF蛋白相互作用，包括OsMORF2b、OsMORF8a、OsMORF8b和OsMORF9，而急性高温处理会减弱这些相互作用。综上所述，这些发现将OsPPR14鉴定为高温下维持叶绿体RNA编辑与剪接的重要因子，并表明其与OsMORF蛋白的温度敏感性相互作用有助于这一功能的发挥。
## 论文解读
### 一、研究背景与科学问题
水稻（*Oryza sativa* L.）是全球重要的粮食作物，其产量实质上是光合产物在籽粒中的有效积累，这一过程由叶绿体驱动，叶绿体的发育状态直接决定光合效率。叶绿体拥有半自主遗传系统，编码约100个对其生物发生和光合功能必需的基因，其基因表达依赖大量由核基因编码、靶向叶绿体的蛋白质。叶绿体基因的转录后调控尤为关键，涵盖mRNA末端加工、多顺反子转录本切割、RNA编辑和剪接等过程，这些修饰的精确执行对产生功能性叶绿体蛋白至关重要。
在调控叶绿体转录后修饰的核编码蛋白中，五肽重复（pentatricopeptide repeat, PPR）蛋白家族尤为突出。水稻中含有491个PPR蛋白成员，根据内部基序结构分为仅含P基序的P型和含P、L、S基序的PLS型两大类。P型PPR蛋白参与细胞器RNA代谢的多个方面，包括RNA稳定性维持、剪接以及部分情况下的RNA编辑。已有研究发现多个水稻P型PPR蛋白如YLWS、CDE4、WSL4、OsPPR4/WSL5和RAS等参与叶绿体RNA编辑和剪接，且部分突变体在低温条件下表现出白化表型。PLS型PPR蛋白则通常作为位点识别因子直接介导细胞器RNA编辑，如DUA1在低温下需要与稳定化因子OsMORF2b互作以防止白化致死表型。
然而，PPR介导的细胞器RNA加工在响应低温胁迫方面的研究已有所开展，而PPR蛋白在高温条件下保护叶绿体功能的贡献在很大程度上仍属未知。因此，鉴定和表征新型高温响应性PPR蛋白，对于阐明水稻耐热性的分子基础以及揭示这一重要蛋白家族的新功能维度具有至关重要的意义。
### 二、研究内容与主要结论
研究人员通过CRISPR/Cas9突变体文库筛选，鉴定到一个高温敏感突变体osppr14#1，并进一步获得独立等位突变体osppr14#2进行验证。OsPPR14（LOC_Os04g46010）编码一个含10个串联P基序的典型P型PPR蛋白，定位于叶绿体，在绿色组织中优势表达，且在35°C下表达水平显著上调。表型分析表明，osppr14突变体在28°C下仅表现生长迟缓、叶片保持绿色，而在35°C下则出现严重叶片白化、叶绿素含量显著降低以及叶绿体超微结构严重破坏。
分子水平分析揭示，OsPPR14的功能缺失在28°C下仅导致atpF和ndhA的剪接缺陷，但在35°C下这些缺陷急剧加重，同时新增多个RNA编辑位点（matK-1258、ndhA-473、ndhA-1070、ndhB-737、rpl2-2和rps14-80）的编辑效率下降，以及ndhB、rpl2、rps12、rps16和ycf3内含子1的额外剪接缺陷。蛋白质互作分析表明，OsPPR14与多个水稻多细胞器RNA编辑因子（Multiple Organellar RNA Editing Factor, OsMORF）家族成员（OsMORF2b、OsMORF8a、OsMORF8b和OsMORF9）在叶绿体内发生物理互作，且急性高温处理（28°C转35°C）可显著减弱这些互作信号，而对照互作对（OsDYW2-OsMORF9）和荧光素酶对照组在相同处理下保持稳定。
### 三、关键技术方法
研究人员主要运用了以下关键技术手段：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术（由常州博格勒生物科技有限公司提供）在粳稻品种中花11（Zhonghua 11, ZH11）背景下创制osppr14突变体；通过Sanger测序法测定叶绿体RNA编辑效率；采用RT-PCR和qRT-PCR定量分析叶绿体内含子剪接效率；借助GFP融合蛋白瞬时表达进行亚细胞定位分析；运用双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）和免疫共沉淀（Co-IP）三种独立方法验证蛋白质相互作用；使用AlphaFold-Multimer进行蛋白互作结构预测；通过透射电子显微镜（TEM）观察叶绿体超微结构。
### 四、主要研究结果
**4.1 OsPPR14功能缺失损害高温下叶绿体发育。** 通过CRISPR/Cas9突变体文库筛选获得osppr14突变体，两个独立等位突变体均在35°C下表现严重叶绿素缺乏和叶绿体发育停滞，而在28°C下仅表现生长迟缓，证明OsPPR14对高温下叶绿体发育至关重要。
**4.2 OsPPR14是一个叶绿体定位的P型PPR蛋白。** 序列分析显示OsPPR14含10个串联P基序且无C末端其他功能域，GFP融合蛋白瞬时表达证实其特异靶向叶绿体，qRT-PCR显示其在叶鞘和叶片中高表达、根中几乎不表达，且35°C处理显著诱导其表达。
**4.3 OsPPR14在高温下为高效叶绿体RNA编辑所必需。** 对全部26个已鉴定叶绿体RNA编辑位点的系统分析显示，28°C下osppr14突变体所有位点编辑效率与野生型无差异，但在35°C下，ndhA-473、ndhA-1070、ndhB-737和rps14-80位点编辑效率大幅下降，rpl2-2和matK-1258呈中等程度降低。
**4.4 OsPPR14还参与叶绿体RNA剪接的维持。** RT-PCR和qRT-PCR分析显示，28°C下突变体仅存在atpF和ndhA剪接缺陷，35°C下atpF和ndhA剪接几乎完全丧失，ndhB、rpl2、rps12、rps16和ycf3的剪接效率也显著降低，相关九个基因的转录本积累量在两种温度下均下降且35°C下降更为显著。
**4.5 OsPPR14与多个OsMORF家族蛋白发生物理互作。** BiFC、LCI和Co-IP三种独立实验一致证明OsPPR14在叶绿体内与OsMORF2b、OsMORF8a、OsMORF8b和OsMORF9发生特异性互作，但不与OsMORF2a互作。OsPPR14受影响的RNA编辑和剪接事件与OsMORF9的调控靶点高度重叠：6个受影响编辑位点中的5个、全部7个受影响剪接事件均与OsMORF9重叠。
**4.6 急性高温处理减弱OsPPR14-OsMORF蛋白间相互作用。** LCI和BiFC温度转换实验显示，从28°C升至35°C后30分钟至1小时内，OsPPR14与四个OsMORF蛋白的互作信号显著下降，而全长荧光素酶对照和温度不敏感的OsDYW2-OsMORF9互作对照信号保持稳定，表明OsPPR14-OsMORF互作具有温度敏感性。
### 五、讨论总结与研究结论
讨论部分指出，osppr14突变体在28°C下已表现出九个相关基因转录本积累量降低，但可检测的RNA加工缺陷仅限于atpF和ndhA剪接，提示OsPPR14可能兼具维持特定叶绿体转录本稳定性的平行功能。35°C下RNA加工缺陷的大幅扩展可能与matK-1258编辑效率下降有关，因为matK编码叶绿体唯一的成熟酶，负责多个II型内含子的剪接，其编辑受损可能加剧剪接系统的整体失效。OsPPR14作为P型PPR蛋白并不直接决定编辑位点特异性，而可能通过与OsMORF蛋白互作参与含MORF的RNA编辑复合体的组装或稳定性维持。研究还指出，OsPPR14-OsMORF互作温度响应性的直接因果证据尚待进一步验证，未来需通过水稻原生质体邻近连接实验、结构引导的界面残基突变等方法加以确认。
研究结论明确：OsPPR14被确立为维持叶绿体RNA编辑和剪接的重要因子，尤其在高温条件下不可或缺。OsPPR14与多个OsMORF蛋白相互作用，且这些互作在急性高温处理下具有温度响应性。OsPPR14功能缺失导致特定叶绿体RNA加工事件在35°C下缺陷逐渐加重，伴随相应叶绿体转录本积累量降低和叶绿体发育受损。该研究揭示了OsPPR14在高温下维持叶绿体RNA加工的先前未被认知的作用，为通过精准调控叶绿体基因表达增强水稻耐热性提供了潜在分子切入点。
