《Poultry Science》：The presence of the
dam gene is important for the proliferation of
Salmonella Typhimurium in egg yolk
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鸡卵是全球沙门氏菌病的重要传播载体。然而，关于沙门氏菌在鸡蛋中（尤其是蛋黄中）增殖的机制性见解仍然缺乏。在此，研究人员采用一组八个调控突变体，以鉴定沙门氏菌在蛋黄增殖过程中所面临的独特胁迫。将鼠伤寒沙门氏菌ST4/74（ST4/74）的调控突变体接种至巴氏消毒
鸡卵是全球沙门氏菌病的重要传播载体。然而，关于沙门氏菌在鸡蛋中（尤其是蛋黄中）增殖的机制性见解仍然缺乏。在此，研究人员采用一组八个调控突变体，以鉴定沙门氏菌在蛋黄增殖过程中所面临的独特胁迫。将鼠伤寒沙门氏菌ST4/74（ST4/74）的调控突变体接种至巴氏消毒蛋黄中，并将其生长动力学分别与同源野生型进行比较。在八个突变体中，编码DNA腺嘌呤甲基转移酶的dam基因的无效突变体在蛋黄中的生长相较于野生型显著降低。进一步证明，dam基因的存在对沙门氏菌在牛乳中的增殖至关重要，但在鸡肉中则不然。编码SPI-1调控蛋白HilD以及氧化应激反应蛋白（如KatN、SodA和MntH）的基因的无效突变体在蛋黄中的生长优于野生型。肠炎沙门氏菌P125109中相同基因的无效突变体表现出与ST4/74中相似的行为，提示这些基因在沙门氏菌蛋黄存活中具有更普遍的作用。总体而言，研究人员的发现为沙门氏菌在蛋黄中存活的机制提供了初步见解。
一、研究背景与问题
食源性疾病是全球性公共卫生关切。仅2019年，美国就有约990万例本土获得性食源性疾病，其中沙门氏菌是最重要的病原体，造成23.8万例疾病、1.25万例住院和238例死亡，估计经济损失达171亿美元。受污染鸡蛋的消费约占美国所有沙门氏菌暴发的10%。在鸡蛋内部，蛋黄是沙门氏菌增殖的主要支持部位，而蛋清则主要具有抗菌活性。
沙门氏菌感染与摄入受污染的食物或水相关，病原体随后侵入肠道上皮，引发胃肠炎。沙门氏菌基因组包含多个沙门氏菌致病岛（SPI），其中SPI-1和SPI-2编码专门的III型分泌系统（T3SS），分别介导宿主肠道上皮细胞的入侵和胞内存活。沙门氏菌快速适应新环境的能力决定了其作为病原体的成功，这种适应性由细菌根据微环境变化迅速重塑转录组的能力所赋予，而这一灵活的转录程序必须由在转录起始水平发挥作用的DNA结合调控蛋白精确控制。
尽管沙门氏菌在蛋黄中增殖的动力学已被充分表征，但特定调控蛋白在病原体适应非宿主环境（尤其是蛋黄等食品基质）中的作用和重要性仍属未知。阐明这些调控基因在蛋黄存活中的作用，不仅有助于理解病原体面临的各种胁迫因素，也有助于表征其适应适应的分子机制。
二、研究内容与主要发现
研究人员以鼠伤寒沙门氏菌ST4/74为模型生物，采用八个等基因缺失突变体，通过分析其在巴氏消毒液体蛋黄中的生长动力学，鉴定沙门氏菌在蛋黄增殖中面临的独特胁迫。结果显示，六个转录因子突变体（ΔssrA、ΔssrB、ΔrpoE、ΔphoPQ、ΔbarA/sirA和ΔompR）的生长与野生型无显著差异；而ΔhilD突变体显著优于野生型生长；Δdam突变体则表现出显著降低的增殖能力。通过将dam基因连同其天然启动子克隆至pBAD质粒进行回补实验，并通过RT-qPCR验证dam基因表达恢复，确认了dam基因对蛋黄增殖的特异性作用。进一步研究表明，dam基因对牛乳中的增殖同样关键，但对鸡肉中的增殖并非必需。在肠炎沙门氏菌P125109中，Δdam和ΔhilD突变体表现出与ST4/74一致的表型。此外，氧化应激反应基因（katN、sodA、mntH）的缺失突变体在蛋黄中表现出延长的迟滞期，但随后生长显著优于野生型，且该表型在两个血清型中一致。
三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用λ Red重组酶一步缺失法构建基因缺失突变体；采用SLiCE无缝连接克隆法构建dam基因回补菌株；通过RT-qPCR验证回补菌株中dam基因的表达水平；在巴氏消毒液体蛋黄、牛乳和鸡肉三种食品基质中进行生长动力学测定，通过平板计数法绘制生长曲线；采用Student's t检验和线性混合效应模型进行统计分析。菌株来源包括Jay Hinton实验室馈赠的ST4/74及其突变体，以及Michael McClelland实验室馈赠的肠炎沙门氏菌P125109。
四、研究结果
蛋黄中ST4/74调控蛋白突变体的生长动力学： 野生型ST4/74在蛋黄中呈现4小时迟滞期、4至8小时对数期及随后稳定期的生长模式。六个转录因子突变体（ΔssrA、ΔssrB、ΔrpoE、ΔphoPQ、ΔbarA/sirA和ΔompR）的生长与野生型无显著差异。ΔhilD突变体则显著优于野生型生长（p=0.01871），这一发现尤为重要，因为HilD是调控SPI-1表达的关键调控蛋白。
dam基因编码的DNA腺嘌呤甲基转移酶对ST4/74蛋黄增殖至关重要： Δdam突变体在所有时间点均表现出较野生型2至4倍的显著生长降低（p=0.002935）。通过pBAD质粒回补dam基因后，生长表型得到恢复，确认了dam基因的特异性作用。RT-qPCR验证了回补菌株中dam基因的转录恢复。
dam基因对牛乳和鸡肉中ST4/74增殖的作用： 在牛乳中，Δdam突变体表现出显著降低的生长（p=0.007151），回补菌株恢复野生型表型；而在鸡肉中，Δdam突变体与野生型无显著差异，表明dam基因在鸡肉中可能并非必需。
肠炎沙门氏菌同样需要dam和hilD才能在蛋黄中存活： 肠炎沙门氏菌P125109中，Δdam突变体生长显著降低（p=0.0002209），ΔhilD突变体生长显著改善（p=0.001026），与ST4/74中的表型一致，提示这些基因在沙门氏菌蛋黄存活中具有普遍作用。
氧化应激反应基因参与蛋黄存活的表型证据： ΔsoxS突变体在蛋黄中表现出8小时的延长迟滞期，但后期显著过度生长（p=0.00001807）。ΔkatN、ΔsodA和ΔmntH突变体均表现出6小时的延长迟滞期，但随后生长显著优于野生型。这些表型在两个血清型中均一致。
五、讨论与结论
研究表明，dam基因编码的DNA腺嘌呤甲基转移酶对沙门氏菌在蛋黄和牛乳中的增殖至关重要。Dam介导的膜稳定性可能对抵御蛋黄中卵黄高磷蛋白等膜靶向胁迫因子具有保护作用。hilD突变体的过度生长表型可能归因于SPI-1 T3SS表达所施加的生长代价，删除hilD可解除这一代价。氧化应激反应突变体的过度生长表型提示蛋黄中富含多不饱和脂肪酸和铁，可诱导脂质过氧化和Fenton反应，使沙门氏菌暴露于氧化胁迫之下。然而，大多数毒力相关调控突变体未在蛋黄中表现出受限生长，提示沙门氏菌蛋黄存活可能由一组迄今尚未表征的、食品基质特异性表达的调控蛋白所调节。总体而言，研究为沙门氏菌在蛋黄中增殖的分子机制提供了初步见解，表明dam、hilD和氧化应激反应基因的作用超越了宿主致病范畴，延伸至食品基质存活领域。
