超声辅助二氧化氯灭活大肠杆菌：影响效率的操作参数、细胞损伤机制及修复抑制

《Process Safety and Environmental Protection》：Ultrasound-assisted chlorine dioxide inactivation of E. coli: Operational parameters governing efficiency, cellular damage mechanism, and repair inhibition

　　

## 摘要

超声（US）与二氧化氯（ClO?）联合消毒系统的运行参数对其消毒性能具有关键影响，然而相关参数的系统性评估及其作用机制仍有待深入探讨。本研究系统考察了运行参数（如ClO?投加量、超声频率、功率、预处理时间、初始细菌浓度及pH值）对消毒效率的影响，并同步评估了不可逆细胞损伤程度以及后续的暗修复和光复活效应。优化结果显示，以6 mg/L ClO?配合3分钟超声预处理（20 kHz、100%功率设置即30 W）为最佳条件，可实现4.53-log10的削减效果，显著优于单独使用ClO?（2.10-log10）。利用扫描电子显微镜和细胞内生物分子定量分析的机理研究表明，联合处理造成了多层次的细胞损伤：破坏细胞包膜完整性，诱导蛋白质泄漏（降解率达30.4%），引发DNA释放，并耗竭胞内ATP，共同破坏细胞稳态。重要的是，该联合体系有效抑制了暗修复和光复活途径，阻止了消毒后的细菌再生，这一优势是传统ClO?消毒所不具备的。将联合体系应用于实际废水二级出水的消毒，验证了其稳健的消毒性能及对消毒副产物生成量的良好控制能力，展现出对复杂水体基质的高度适应性。这些结果表明，在精心优化的运行参数调控下，超声增强的ClO?消毒技术为水处理应用中高效、环保的病原体控制提供了有前景的策略。

## 引言

水体中的病原微生物对公共健康和安全构成严重威胁。据世界卫生组织（WHO）统计，全球仍有约17亿人使用受病原体污染的饮用水源，22亿人缺乏安全管理的供水服务（Cano等，2025）。水传播病原体主要包括细菌、原生动物、寄生虫和病毒，其中大肠杆菌（E. coli）是典型的粪便指示微生物，也是废水中的代表性病原体，对人体和动物健康构成潜在风险（Zheng和Lo，2021）。大肠杆菌感染可引起包括呼吸衰竭、胃肠疾病和急性肾衰竭在内的严重疾病，对婴幼儿、老年人和免疫功能低下人群影响尤为严重（Du等，2023；Wei等，2023）。因此，开发高效的消毒技术对于保障水质安全和维护公共健康至关重要。

消毒是水处理中灭活病原微生物、阻断水传播疾病的关键单元过程。传统的化学消毒剂，包括氯、臭氧、二氧化氯（ClO?）和氯胺，已广泛应用于饮用水、游泳池水和回用水处理中（Sun等，2019）。这些消毒剂的灭活效果主要取决于其在微生物靶标上的吸附和富集，通常涉及三个关键位点：基于肽聚糖的细胞壁、维持细胞稳态和物质运输的半透性细胞质膜，以及承载代谢和复制功能的细胞质。无论具体靶标位点如何，最终致死机制表现出高度一致性，主要表现为：破坏跨膜质子动力势导致氧化磷酸化解偶联、抑制呼吸链和代谢合成途径、损害遗传物质复制、丧失膜完整性导致胞内重要组分泄漏，以及胞内物质凝固变性（Xiao等，2019）。然而，化学消毒剂的应用存在显著缺点，特别是会产生消毒副产物（DBPs）。紫外（UV）辐照是广泛使用的水消毒技术，能有效灭活多种病原体且不产生消毒副产物（DBPs）。它对耐氯微生物具有高度有效性（Wang等，2022a；Wang等，2022b），通过损伤细菌的DNA和/或蛋白质实现灭活（Tang等，2026）。然而，近期的一篇综述强调，全尺度UV性能主要取决于实际水体中的辐照剂量递送，而基质光学特性（如浊度/悬浮固体）和颗粒遮蔽效应是关键限制因素（Deng等，2026）。

近年来，超声（US）作为一种在实际应用中前景广阔的治理技术，具有优异的指向性、强穿透力、近零污染和高实用性等特点（Matafonova和Batoev，2019）。此外，低频超声在废水处理中被认为有效，因此研究人员经常采用低频超声（<100 kHz）与消毒剂联用进行病原体灭活（Vajnhandl等，2015）。低频超声主要发挥物理效应，包括冲击波、剪切力、局部加热和微射流，导致细菌细胞膜的机械破坏，而化学效应和热效应仅起辅助作用（Bai等，2023；Zhou等，2016a）。与紫外辐照相比，超声似乎受水体浊度的影响较小（Gao等，2026）。此外，超声产生的机械剪切力可破碎较大颗粒并打散絮体，从而将颗粒关联细菌暴露于紫外辐照和消毒剂作用下，显著提高整体消毒效率（Zhou等，2016a）。二氧化氯（ClO?）作为世界卫生组织（WHO）和美国环保署（EPA）推荐的绿色消毒剂，在消毒副产物（DBP）控制方面受到关注，其具有高氧化电位（1.91 V）、广谱消毒能力以及相较于氯而言显著降低的DBP生成量（Ye等，2023；Mzinyathi等，2025；Paula Rossi等，2021）。ClO?的主要消毒机制涉及细胞膜的结构性损伤和通透性改变，导致胞内物质泄漏，蛋白质的氧化修饰和核酸损伤作为协同灭活途径（Paula Rossi等，2021）。然而，水中的悬浮颗粒可保护被包裹的微生物免受消毒剂作用，从而降低消毒效率或需要增加ClO?投加量（Zhou等，2016a）。此外，虽然ClO?最大限度地减少了有机DBP的生成，但其应用引发了对无机副产物的严重关注，特别是亚氯酸盐（ClO??）和氯酸盐（ClO??），这些物质被怀疑对人体健康和环境存在潜在风险（Xu等，2022）。

尽管超声和ClO?各自具有优势，但单独使用任一处理方式均无法达到最佳消毒效率，且单独使用超声在高能耗和大規模应用中的灭活效率较低（Bai等，2023）。超声与ClO?联合已显示出协同灭活微生物的效果，先前的研究报道了该联合处理对鸡产品加工冷却水中鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌灭活率的提升（Paula Rossi等，2021）。在此背景下，超声可以通过不同的运行模式发挥作用，即作为预处理步骤或同步超声/ClO?消毒，每种模式均产生不同的效果，包括解絮、细胞损伤、协同消毒以及可能导致溶解态ClO?消解的释气或声化学反应（Zhou等，2016a）。Zhou等（2016a）证明，在输入功率密度为2.64 kJ/L的超声预处理条件下，可在二级出水中将所需ClO?投加量减半以实现相同的消毒效率，同时显著减少ClO??和ClO??的生成量。然而，超声与ClO?联合消毒的协同机制仍未被完全理解，运行参数的系统性优化也缺乏。此外，该联合工艺对实际水体基质中细菌再生潜力、光复活效应和DBP生成的影响需要全面评估以判断其实际适用性。值得注意的是，虽然已有研究探讨了超声与氯、过氧乙酸联用（Bai等，2023；Zhou等，2016b），但关于低频超声与ClO?序贯和同步应用进行水消毒的系统研究——特别是兼顾消毒效率评估和灭活机制阐释方面——仍然有限。

因此，本研究系统考察了低频超声联合ClO?对大肠杆菌的灭活效果和机制。具体目标为：(i) 比较不同处理顺序的消毒性能，包括超声预处理后ClO?处理（US + ClO?）和同步超声与ClO?处理（US/ClO?），并优化运行参数，如ClO?投加量、超声频率、超声功率、预处理时间、初始细菌浓度、初始溶液pH值和水基质成分；(ii) 通过扫描电子显微镜（SEM）形态观察和胞内蛋白质、DNA及ATP泄漏定量分析阐明灭活机制；(iii) 通过暗修复和光复活实验评估细菌再生潜力；(iv) 评估超声与ClO?联合体系在实际废水出水中的应用可行性及其对DBP生成的影响。本研究旨在为超声辅助二氧化氯消毒技术的工程应用提供科学依据。

## 材料与方法

### 材料

大肠杆菌（BNCC 133264）购自北纳生物（北京，中国）。大肠杆菌（BNCC 133264）在LB培养基中37℃、150 rpm振荡培养18-24小时。然后将细胞收集并悬浮于生理盐水中，调整至10? CFU/mL（OD??? = 0.5-0.8）备用。实验所用ClO?购自上海宏坤生物科技有限公司（上海，中国）。其余所有化学品均购自国药试剂公司（上海，中国）。

### 不同处理对大肠杆菌的灭活

进行了一项预实验以评估六种条件下大肠杆菌的灭活效率：单独NaClO、单独ClO?、超声预处理后NaClO（US + NaClO）、同步超声和NaClO（US/NaClO）、超声预处理后ClO?（US + ClO?）以及同步超声和ClO?（US/ClO?）。结果如图1所示。与单独消毒相比，所有涉及超声的处理方式均实现了更高的大肠杆菌灭活率。

## 结论

本研究系统考察了序贯低频超声预处理后ClO?消毒对大肠杆菌的灭活作用，重点研究了影响消毒效率的运行参数、潜在的细胞损伤机制以及消毒后修复抑制效果。在所评估的各种处理配置中，超声预处理后序贯ClO?处理始终实现了最高的灭活效果，在15分钟时达到4.53-log10的削减效果。

### CRediT作者贡献声明

付翔：写作—审校与编辑、可视化、形式分析。田福祥：可视化。高宇琼：写作—审校与编辑、原创草稿撰写、监督、经费获取、概念构思。唐惜惜：原创草稿撰写、可视化、形式分析、数据整理。陈菊香：验证。余亭亭：可视化、形式分析、数据整理。

### 利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

### 致谢

本研究受上海市自然科学基金（编号：24ZR1452900）和2025年石东医院科研创新团队项目（KYCX2508）资助。

高宇琼 | 唐惜惜 | 余亭亭 | 陈菊香 | 田福祥 | 付翔