新型鹅星状病毒2型JSYC2503株的分离鉴定与系统发育分析

《Poultry Science》：Isolation, Identification and Phylogenetic Analysis of a Novel Goose Astrovirus 2 Strain

　　

摘要 2025年，中国江苏省某鹅场暴发急性肾炎并伴有生长迟缓的疫情。受感染雏鹅表现出典型的痛风症状，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）确认其为单纯感染鹅星状病毒2型（GAstV-2）。研究人员利用来杭鸡雄性肝癌（LMH）细胞系从肝脏组织中成功分离出一株新型毒株，命名为JSYC2503。该毒株在72小时内诱导产生明显的细胞病变效应（CPE），并在连续20次盲传后仍保持稳定。JSYC2503的全基因组由7,180个核苷酸组成，呈现典型的星状病毒基因组结构，包括保守的核糖体移码信号和位于3‘非翻译区（3’-UTR）的茎环II样基序（s2m）。系统发育分析将JSYC2503归入GAstV-2分支，其与我国GAstV-2毒株JXNC1的全基因组序列一致性最高（99.6%），而与其他禽星状病毒的一致性则显著较低（29.9%–47.1%）。在实验感染研究中，经腹腔接种JSYC2503的3日龄雏鹅出现临床症状，第6天死亡率达50%，并表现出脾肿大、法氏囊萎缩及肾脏尿酸盐沉积等病理变化。泄殖腔拭子中持续检测到病毒脱落。上述结果表明，JSYC2503是一株高致病性GAstV-2毒株，可能对鹅群健康构成重大威胁，其基因组特征为鹅星状病毒的进化和致病机制研究提供了重要参考。

新型鹅星状病毒2型JSYC2503株的分离鉴定与致病性研究解读

一、研究背景与意义

鹅星状病毒2型（GAstV-2）已成为我国主要水禽产区雏鹅内脏痛风和高死亡率的重要病原体，对养鹅业造成重大经济损失。GAstV-2属于禽星状病毒属（Avastrovirus），基因组为单股正链RNA，包含5’非翻译区（5’-UTR）、三个开放阅读框（ORFs）、3‘非翻译区（3’-UTR）及多聚腺苷酸尾。基于ORF2序列的系统发育分析已将鹅星状病毒划分为两种基因型，其中GAstV-2是与临床痛风暴发相关的主要基因型。然而，当前对流行田间毒株的遗传多样性和致病异质性仍缺乏系统认识。尽管已有多个GAstV-2分离株通过不同培养体系获得，但对其体内致病性的系统表征，特别是组织嗜性和传播动力学方面的研究仍十分有限。此外，持续监测新变异株的出现对于制定有效防控策略至关重要。因此，本研究旨在从临床痛风暴发案例中分离GAstV-2毒株，解析其全基因组序列、系统发育关系及重组潜力，并在实验感染雏鹅中评估其致病性，以提供当代参考毒株并加深对GAstV-2致病机制和进化规律的理解。

二、研究内容与主要结论

研究人员于2025年3月从江苏省盐城市某大型鹅场采集10日龄病鹅的肝脏和肾脏组织样本，该鹅场暴发了急性肾炎和生长迟缓疫情。通过特异性引物进行RT-PCR检测，确认病料仅感染GAstV-2，同时排除了鹅细小病毒（GPV）、新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）、禽流感病毒（AIV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）和鹅圆环病毒（GoCV）等常见病原体的共感染。利用LMH细胞系对肝脏组织匀浆进行病毒分离培养，在接种后72小时内观察到典型的细胞病变效应，包括细胞变圆和大量脱落。经连续20次盲传后，病毒仍能稳定诱导典型CPE，表明该毒株已成功适应LMH细胞培养体系，并命名为JSYC2503。

全基因组测序结果显示，JSYC2503基因组全长7,180个核苷酸，包含18个核苷酸的5’-UTR、三个重叠的开放阅读框（ORF1a：3,255 nt；ORF1b：1,560 nt；ORF2：2,115 nt）和232个核苷酸的3’-UTR。ORF1a编码1,085个氨基酸的非结构多聚蛋白，包含类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶结构域（aa 554–706）、核定位信号（NLS，₇₇₃KKKGKTKKTARGN₇₈₅）、两个卷曲螺旋结构域、四个潜在跨膜结构域和一个保守的锌指样DNA结合基序。ORF1b编码由387个氨基酸组成的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），其与ORF1a之间的连接区存在七聚体核糖体移码信号（AAAAAAC）及下游茎环结构。ORF2编码衣壳前体蛋白，是基因组中变异程度最高的区域。基因组5’端和ORF1b终止密码子与ORF2起始密码子之间的18个核苷酸基因间隔区均存在星状病毒保守的CCGAA基序。Rfam分析在3’-UTR区（nt 6958–7000）鉴定出s2m基序。

序列同源性分析表明，JSYC2503与鹅星状病毒毒株JXNC1在基因组水平一致性最高（99.6%），氨基酸水平上ORF1a、ORF1b和ORF2的一致性分别为99.8%、99.4%和99.7%。相比之下，JSYC2503与其他禽星状病毒的全基因组一致性仅为29.9%–47.1%，ORF1a、ORF1b和ORF2氨基酸一致性分别为29.8%–58.9%、53.7%–70.9%和29.9%–56.6%，即使与同样分离自鹅的FLX毒株（GAstV-1）也仅具有40.5%的全基因组一致性。基于全基因组和ORF1a、ORF1b、ORF2核苷酸序列构建的系统发育树中，JSYC2503均稳定聚集在GAstV分支内，与JXNC1和HNIG等中国GAstV分离株形成高支持率（bootstrap > 95%）的单系群，与鸭星状病毒（DAstV）、火鸡星状病毒（TAstV）、鸡星状病毒（CAstV）和禽肾炎病毒（ANV）等参考毒株形成明显分离的独立分支。各基因树之间未观察到显著拓扑不一致，提示JSYC2503未涉及种间重组事件。

动物攻毒实验采用3日龄健康雏鹅经腹腔接种JSYC2503病毒液（10^6.68 TCID₅₀/mL，每只0.4 mL），对照组接种等量无菌PBS。感染组雏鹅在感染后第2天开始出现死亡，至第6天累计死亡率达50%。存活个体表现出精神沉郁、采食量下降、生长迟缓、腿关节肿胀、无法站立及行走困难等典型症状。感染后第7天剖检发现主要病理变化集中在肝脏、脾脏、法氏囊和肾脏：肝脏肿大变色，脾脏显著肿大，法氏囊明显萎缩，肾脏严重肿胀并伴有大量尿酸盐沉积，与内脏痛风的特征性病变一致。

三、主要技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：临床样本的RT-PCR病毒分型检测及多种常见禽类病原体（GPV、NDRV、AIV、DTMUV、GoCV）排除检测；利用LMH细胞系进行病毒分离和连续20次盲传培养；通过cDNA末端快速扩增技术（RACE-PCR）结合五对重叠引物进行全基因组扩增和测序组装；利用ORFfinder、SMART、NLStradamus和Rfam等生物信息学工具进行开放阅读框预测、蛋白结构域分析、核定位信号预测和RNA茎环结构分析；采用MEGA 11.0软件基于最大复合似然模型和邻接法构建系统发育树（1,000次bootstrap重复）；以及3日龄雏鹅的腹腔接种动物攻毒实验。样本来源于江苏省盐城市某大型鹅场。

四、讨论与结论

讨论部分指出，JSYC2503与已报道GAstV-2毒株间>99%的核苷酸一致性表明该分离株属于当前中国东部流行的优势谱系，而非新出现的变异株。实验感染中观察到的严重内脏痛风、50%死亡率以及脾肿大和法氏囊萎缩等病变提示GAstV-2可能同时靶向淋巴组织，这种淋巴嗜性可能损害宿主免疫功能并增加继发细菌感染的风险。基于病理发现，研究人员提出GAstV-2相关痛风发病的双通路模型：一是病毒对肾小管上皮细胞的直接损伤可能干扰尿酸排泄，可能通过影响ABCG2和SLC2A9等尿酸盐转运体实现；二是感染雏鹅的肝脏肿大和多灶性坏死提示肝损伤可能进一步加剧嘌呤代谢紊乱，促进内脏组织尿酸盐沉积。3’-UTR中s2m基序的高度保守性提示其在病毒复制和自然重组中可能发挥重要功能，值得通过反向遗传学进一步验证。JSYC2503未检测到重组信号，从疫苗开发角度具有遗传稳定性优势，但GAstV-2与新型鹅肾炎病毒和GoCV在我国水禽群体中的共流行强调了持续分子监测的重要性。研究局限性包括腹腔攻毒途径绕过了自然的口-粪传播途径，以及未对各器官病毒载量进行定量分析。

结论：综上所述，研究人员从中国江苏省痛风雏鹅中分离出一株新型GAstV-2毒株JSYC2503。该病毒在LMH细胞中成功传代并保持体外感染稳定性。基因组和系统发育分析确认JSYC2503属于GAstV-2分支，与近期流行的中国毒株亲缘关系密切。实验感染证明该分离株对雏鹅具有高致病性，可引起严重临床疾病、特征性痛风病变和显著死亡率。上述结果为GAstV-2的分子进化和致病机制提供了重要见解，并为鹅星状病毒感染的防控建立了重要参考。