《Cancer and Metastasis Reviews》：Extracellular vesicles shape tumourigenesis: from signalling networks to systemic progression
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是癌症中长距离细胞间通讯的既定介质，可转移致癌及调控性货物，从而重塑受体细胞的组织状态。近期针对健康人类供体小细胞外囊泡（small EVs, sEVs）的整合性多组学分析一致鉴定TSAP6/STEAP3为最丰富且可重复性最高的sEV组分之一，为其在sEV生物学中的作用提供了生理学背景。TSAP6并非仅作为p53的下游效应因子发挥作用，而是通过与TPT1/TCTP结合，后者与DDX3相互作用并促进RNA（包括microRNA）整合进入sEVs，从而在更广泛的调控网络中发挥作用。由此形成的p53–TSAP6–TCTP–DDX3轴构成一个具有非细胞自主性细胞通讯影响的广泛调控系统。值得注意的是，即使在p53突变背景下，TCTP仍能维持sEV介导的信号传导。研究人员认为，这些发现与癌症中将致癌转化与EV生物学联系起来的其他进展相一致。总之，这些观察支持受调控的EV介导信息传递作为促进癌症进展和系统性细胞重编程的一种机制。相反，EV丰度减少、货物含量改变或信号传导能力下降可能促进TCTP依赖性实验模型中肿瘤归转程序的激活。
1 引言
细胞外囊泡（EVs）研究领域的快速扩展已产生了丰富的研究成果。本文聚焦于近期发现[1,2,3]及其与既往研究[4,5]的整合，这些工作共同指向EV领域正在形成的概念整合。与本文框架特别相关的两个方向是：第一，EV在非细胞自主性致癌信号传导中的作用[2,3]，通常被称为致癌物质的水平转移；第二，肿瘤来源EV对全身性癌症相关病理的贡献[6,7]。
“细胞外囊泡”是一个总称术语，涵盖由脂双层界定的囊泡，由细胞释放并能够携带多种分子，包括信号受体、膜结合配体、黏附分子、酶、脂质、核酸和代谢物[8,9]。EV在大小、生物发生、分子组成和功能上具有异质性[10,11]，反映了不同运输效应因子和囊泡形成机制的参与[11]。EV分离和表征技术的进步对于解析这种多样性并定义不同的EV群体至关重要[12]。其中，小细胞外囊泡（sEVs），通常在30–150 nm范围内，可通过不同的生物发生途径产生[13]。外泌体构成sEV中来源于内体的一部分，起源于多囊泡内体中的内腔囊泡，并与质膜融合后释放[14,15]。由于这种内体来源通常难以确定，尤其是在体内，因此当精确生物发生起源不确定时，使用更广泛的术语sEV[15]。
EV介导的通讯可通过自分泌和旁分泌信号在局部起作用，也可在通过循环播散后在远处起作用[10,11]。这种局部和长距离分子交换的能力与癌症作为一种多细胞和全身性疾病尤其相关。因此，核心问题是：调控sEV生物发生、组成和生物活性的分子通路如何与致癌转化交叉，并促进肿瘤微环境的重编程和疾病的全身性播散。确定这些通路是否影响EV介导通讯的强度和生物学后果，以及它们是否代表潜在的治疗靶点，具有重要意义。
在以下各节中，将这些新兴发现整合到肿瘤抑制因子激活通路-6（TSAP6/STEAP3）和翻译控制肿瘤蛋白（TCTP/TPT1）轴的框架内，该轴处于应激生物学、囊泡生物发生、EV介导信号传导以及恶性进展与肿瘤归转之间的平衡[1,2]。
2 p53-TSAP6/STEAP3-TCTP轴
一项针对循环人类sEVs的最新多组学分析为人类囊泡相关通路提供了生理学背景[1]。该研究使用高分辨率碘克沙醇密度梯度分离sEVs，结合定量蛋白质组学和脂质组学，将囊泡与丰富的血浆蛋白和脂蛋白污染物分离，并鉴定了一个跨个体共享的保守“核心”特征，包含182种蛋白质和52种脂质。重要的是，TSAP6/STEAP3在该保守特征集中被检测到，与flotillins、Rabs、annexins和SNARE相关因子等已确立的内体和运输蛋白并列。这些发现确定了TSAP6/STEAP3存在于健康个体循环sEVs中，尽管释放这些囊泡的细胞来源和生理状态仍然未知[1]。
TSAP6（图1）最初是在差异cDNA展示筛选中被鉴定，该筛选旨在将p53诱导凋亡的分子图谱扩展到经典细胞周期调控因子之外[16]。使用温度敏感的LTR6系统，恢复野生型p53活性揭示了十个先前未表征的转录本，其中TSAP6被选中进行进一步分析。
图1 全尺寸图像
p53–TSAP6/STEAP3–TCTP–DDX3–microRNA通路在应激诱导的sEV信号传导中的作用。上图：基因毒性应激后，p53诱导TSAP6/STEAP3表达并促进sEVs释放。TSAP6/STEAP3与TCTP相互作用并促进其囊泡输出。TCTP调节sEV释放和货物组成，并与DDX3相互作用，后者促进RNA（包括microRNA）募集进入sEVs。在受体细胞中，转移的囊泡货物有助于凋亡旁观者反应（红色箭头）。下图：p53或TSAP6/STEAP3的缺失，或TCTP的条件性删除，在不同水平破坏该通路，导致sEV释放减少和/或货物组成改变。因此，sEV介导的旁观者信号传导减弱（蓝色箭头）。该图使用BioRender.com创建。
后续工作证明，TSAP6是p53通过其启动子中特定的p53反应元件直接转录调控的靶基因[17]。据报道，TSAP6通过与Nix/BNIP3L和Myt1激酶相互作用调节凋亡和细胞周期进程，将其与促凋亡信号传导和G2/M检查点控制联系起来。一项重要进展来自TSAP6调节非经典蛋白分泌的证据。TSAP6直接结合TCTP（下一节将更详细地综述），其过表达增加细胞外TCTP释放。这种分泌对常规内质网–高尔基体通路的抑制不敏感，TCTP在小囊泡组分中被检测到，与外泌体一致[18]，从而将p53响应的TSAP6通路与受调控的囊泡介导蛋白输出联系起来。
这一概念进一步由Arnold Levine及其同事巩固，他们证明p53激活诱导外泌体分泌作为DNA损伤反应的一部分[19]。在肺癌细胞系中，γ照射以p53依赖性方式增加外泌体产生，该效应在机制上与TSAP6诱导相关。仅TSAP6表达就足以增强外泌体释放。
TSAP6的生化身份在其被表征为STEAP3后进一步明确，STEAP3是前列腺六次跨膜上皮抗原（STEAP）家族的成员[20]。Ohgami等人证明STEAP3与转铁蛋白循环内体共定位，并作为内体铁还原酶，是红系细胞中有效的转铁蛋白依赖性铁摄取所必需的；因此，Steap3缺陷小鼠出现小细胞低色素性贫血[20]。与TSAP6和STEAP3的身份一致，Lespagnol等人产生的TSAP6敲除小鼠显示异常网织红细胞成熟和转铁蛋白受体下调缺陷[4]。TSAP6也被检测到存在于反高尔基体和内体-囊泡区室中，与转铁蛋白受体和早期内体标记物部分共定位，而原代TSAP6缺失细胞在基因毒性应激后表现出显著减少的外泌体释放[4]。
这两项研究描述了同一TSAP6/STEAP3基因产物的互补方面，而非红系细胞中独立的分子通路。Pan和Johnstone先前已证明，在网织红细胞成熟过程中，转铁蛋白受体被选择性地外化到囊泡中[14]。总之，这些观察提供了遗传和细胞证据，将TSAP6/STEAP3与网织红细胞成熟过程中的囊泡运输及受调控的外泌体分泌联系起来[4]。人类遗传学进一步证实了STEAP3的生理相关性，在先天性低色素性贫血中鉴定出TSAP6/STEAP3的无义突变[21]。
泛癌分析（https://www.cbioportal.org/）表明，STEAP3在人类癌症基因组水平的改变不频繁，没有复发的突变热点，只有罕见的高水平拷贝数或结构改变，尽管STEAP3过表达已在多种肿瘤类型中被描述。
总之，这些发现建立了一个框架：TSAP6通过差异cDNA筛选的初步鉴定[16]、其受p53调控[17]、其在囊泡运输中的作用[18]、其参与p53依赖性外泌体调控[19]，以及基因消融模型的证据[4]，共同将p53–TSAP6–TCTP轴与细胞外囊泡生物学联系起来。在这种背景下，TSAP6作为一种膜蛋白，参与调控p53依赖性囊泡介导的细胞间通讯。
一个合理的下一步是确定在大型患者队列中，TP53状态（包括特定突变类别）是否与TSAP6表达、囊泡丰度或EV货物组成相关，以及含有TSAP6的sEVs是否在肿瘤进展中具有生物标志物或功能相关性。在循环人类sEVs提供的生理学框架内[1]，STEAP3在全部38个血浆EV蛋白质组中被检测到，而TCTP在38个中的18个中被检测到。由于这些测量是从bulk sEV制剂中获得的，因此不能确定STEAP3和TCTP是否共存于同一囊泡中或分布在不同sEV亚群中（https://evmap.shinyapps.io/evmap）。相反，两种蛋白在循环sEV制剂中的检测表明，它们在sEVs中的存在不限于基因毒性应激或癌症。此外，有证据表明TCTP在sEVs中的功能超出了经典的p53–TSAP6轴[2]，如下一节所讨论。
3 TCTP囊泡信号传导与p53轴的解耦
尽管TCTP生物学已被广泛综述[22]，此处简要概述以将其在EV分泌和货物调控中的作用置于背景中。后来被认定为TCTP的蛋白质的翻译调控在George Brawerman及其同事的早期研究中已很明显[23]。TCTP随后被Susan MacDonald及其同事鉴定为组胺释放因子（HRF）[24]，确立了其在过敏性炎症中的细胞外作用，并预示其在细胞间信号传导中的更广泛功能。在研究人员对肿瘤归转程序的研究中，使用差异基因表达方法，包括Megasort和大规模平行签名测序（MPSS），在U937肿瘤细胞中检测到248个对应于TCTP mRNA的信号，而仅在2个归转US细胞中检测到[25]。此外，抑制TCTP也促进了乳腺癌细胞重组为导管样结构[25,26]。
TCTP参与生长控制、细胞骨架组织、蛋白质合成和延伸机制[22]。对TCTP功能的进一步了解来自Edouard Azzam及其同事在人类成纤维细胞和骨肉瘤细胞中的研究，这些研究将TCTP确定为哺乳动物DNA损伤反应的组成部分[27]。独立地，Kwang-Wook Choi及其同事在果蝇中的一系列遗传研究确立了Tctp作为基因组稳定性和染色质组织调控因子的作用[28,29]。
TCTP的抗凋亡活性是其最特征明确的功能之一[25,30,31]。生物学和结构研究表明，TCTP含有BH3样结构域，为其与BCL2家族凋亡调控因子的相互作用提供了机制基础[32]。TCTP还表现出不寻常的能力，可激活BCL2家族成员Bcl-xL的抗凋亡功能[32]。
TCTP通过外泌体分泌的发现扩展了其功能范围[18]，尽管囊泡释放的后果仍不清楚。近期工作表明，TCTP有助于sEV的产生、货物组成和受体细胞中的生物活性[2]（图1和图2）。这些发现揭示了一个明显的悖论：尽管细胞内TCTP具有公认的抗凋亡功能，但它是基因毒性应激后释放的sEVs传递促凋亡信号所必需的。这个明显的悖论可以通过区分TCTP的细胞内功能与其在囊泡通讯中的作用来解决。在供体细胞中，TCTP有助于sEV产生和货物选择，但本身并不决定传递的信号是促凋亡还是抗凋亡。相反，受体细胞的反应反映了供体细胞的生理状态和整合到囊泡中的分子货物。因此，从经历基因毒性应激的照射细胞释放的sEVs可以传递促凋亡信号（图1），而从肿瘤细胞释放的TCTP依赖性sEVs可以传递促肿瘤活性（图2）[2]。
图2 全尺寸图像
TCTP依赖性sEV通讯在多个生物系统中调节恶性生长，TCTP敲低或条件性敲除诱导肿瘤归转。左图：TCTP高表达肿瘤细胞（红色）包括人乳腺癌细胞系MCF-7、T-47D、SK-BR-3和MDA-MB-231，以及鼠ITR-1肿瘤细胞系。乳腺癌细胞中的TCTP敲低（KD；蓝色）或ITR-1细胞中的条件性Tctp敲除（cKO；蓝色）减少恶性生长，产生TCTP低表达的归转表型（蓝色）。TCTP高表达亲本肿瘤细胞（红色）释放的sEVs恢复TCTP低表达归转细胞（蓝色）的恶性表型，而TCTP低表达归转细胞（蓝色）释放的sEVs则不能。右图：TCTP高表达状态（红色）与体内更大的肿瘤生长和更短的生存期相关，而TCTP缺失（蓝色）在Trp53缺失小鼠中减少肿瘤发展并显著延长生存期。该图使用BioRender.com创建。
照射细胞sEVs传递的促凋亡反应与Azzam、Little及其同事建立的辐射诱导旁观者效应一致[33]。在诱导性Tctp敲除胸腺细胞中，该反应的sEV介导组分是TCTP依赖性的，Tctp缺失减少sEV释放并改变囊泡蛋白和RNA含量[2]。伴随的RNA货物变化为潜在机制提供了见解。RNA（包括mRNA和miRNA）是囊泡货物的既定功能组分，可转移到受体细胞[8]。
在所测试的实验条件下，未检测到TCTP与RNA的直接结合。相反，TCTP与RNA解旋酶DDX3直接相互作用，并增强DDX3与let-7c-5p的关联[2]。与miRTarBase的比较显示，注释为靶向DDX3X的128个miRNA中有43个也在抗TCTP CLIP数据集中被鉴定[2,34]。总之，这些发现支持一个模型，其中TCTP通过DDX3促进miRNA募集进入sEVs。
TCTP在sEV生物学中的作用不仅限于应激诱导的分泌。在易患肿瘤的Trp53缺失小鼠中，Tctp的条件性缺失减少肿瘤形成并延长Trp53–/–;Tctp–/f–双敲除模型的生存期[2]。在一部分小鼠中，进一步诱导Tctp缺失导致已建立肿瘤的消退，表明TCTP在缺乏p53的情况下对肿瘤发展和维持均有贡献（图2）。
由于这些小鼠中循环肿瘤来源sEVs未被直接测量，其潜在贡献使用诱导性肿瘤归转-1（ITR-1）细胞进行检查，该细胞系来源于Trp53–/–;Tctp–/f小鼠中产生的肉瘤。剩余Tctp等位基因的条件性缺失（图2），产生Trp53–/–;Tctp–/f–细胞，损害生长、减少sEV分泌并降低剩余囊泡的蛋白质和RNA含量。用来自TCTP胜任亲本ITR-1细胞的sEVs补充（图2）恢复生长，支持TCTP依赖性、囊泡介导的促肿瘤回路[2]。
在人类乳腺癌细胞中也观察到类似的TCTP依赖性。TCTP敲低在四种具有不同TP53状态的细胞系中减少自发sEV分泌：MCF-7（野生型TP53）、T-47D（L194F）、SK-BR-3（R175H）和MDA-MB-231（R280K）[2]。TCTP耗竭也损害生长，但可通过补充来自相应TCTP胜任亲本细胞分离的sEVs来恢复（图2）。这些效应在野生型和突变TP53背景（包括特征明确的p53功能获得性突变R175H和R280K）中的一致性表明，TCTP依赖性sEV分泌和支持生长的活性在这些模型的不同p53背景下得以维持[2]。这是否也适用于人类肿瘤仍有待确定。由于这些分析是在bulk sEV制剂上进行的，因此不能确定TCTP耗竭是否类似地影响所有释放的囊泡，或改变不同sEV群体的相对丰度和组成。
这些肿瘤模型对TCTP的依赖性也识别出一个潜在的治疗脆弱点。使用舍曲林（sertraline）治疗，该药物结合TCTP并抑制其功能，延长了Trp53–/–小鼠的生存期，表明TCTP在缺乏p53的情况下可能仍可作为治疗靶点[2]。
在p53突变或缺失时TCTP依赖性sEV分泌和信号传导的持续存在，支持在所检查的模型中这种囊泡活性与经典p53应激反应轴的功能解耦。然而，TCTP和p53仍然通过相互调控环连接：TCTP促进MDM2依赖性p53降解，而p53直接抑制TCTP转录[35]。因此，野生型p53功能的丧失可能解除对TCTP的转录约束，而升高的TCTP可能进一步降低p53水平。在同一研究中，508例乳腺癌队列中的高TCTP表达与低分化、侵袭性肿瘤相关，并独立预测较差的无病生存期，无论是考虑远处事件还是所有事件[35]。
TCTP依赖性sEV信号传导是否将相互的p53–TCTP环与肿瘤侵袭性、患者结局和全身性后果联系起来，仍有待人类肿瘤研究确定。更广泛地说，失调的TCTP活性和p53功能障碍可能共同重塑细胞内程序和细胞外通讯，从而促进肿瘤进展。
4 EVs作为致癌转移和全身性癌症进展的载体
在过去二十年中，一系列基础性观察已确定EV不仅受致癌转化调控，还能携带功能性致癌物质[5,36,37]。此处考虑两个相关维度：第一，致癌物质在肿瘤细胞与周围细胞群体之间的水平转移；第二，EV介导的远处部位通讯，包括其对全身性癌症相关反应和转移性播散的贡献。
研究人员首次提供了表达突变致癌受体EGFRvIII的胶质瘤细胞释放富含该致癌蛋白的EVs的证据[5]。这些癌症来源的EVs能与EGFRvIII阴性细胞融合并激活MAPK和Akt信号传导，从而促进增殖、生存和血管生成[5]。该研究确立了通过肿瘤来源囊泡进行致癌物质水平转移的原则，即一个肿瘤细胞群体释放的生物活性致癌物质可被另一群体获得并改变受体细胞的信号传导和表型。最近，间充质胶质瘤干细胞来源的EVs被证明可向内皮细胞传递EGFR，并促进不依赖VEGF的肿瘤新生血管形式，称为血管扩张（vasectasia），该形式对常规抗血管生成药物具有耐药性[3]。携带EGFR的癌症EVs也可与小胶质细胞相互作用并改变其分子特性[38]。因此，EV介导的致癌转移不仅可以发生在肿瘤细胞群体之间，还可以跨越肿瘤微环境的不同细胞区室。
这一原则不限于EGFRvIII。例如，EV介导的肿瘤相关致癌物质转移也已被报道用于扩增的野生型EGFR[39]、MET[40]和致癌H-RAS DNA[41]等。这些研究涵盖了蛋白质和核酸货物的转移，并共同证明EVs可以在细胞之间转移具有生物活性的肿瘤相关分子。重要的是，由此产生的信号传导或表型效应不一定意味着稳定的致癌转化。正常受体细胞可以对水平转化施加肿瘤抑制屏障[42]。
一个相关但不同的问题是致癌信号如何调控参与这些相互作用的EV的产生和组成。配体刺激后，EGFR进入内体和内腔囊泡的运输受受体激活、泛素化和ESCRT依赖性分选调控[43]，而致癌变体如EGFRvIII在运输特性上与配体激活的野生型EGFR不同[44]。
EGFR运输在细胞应激下也可被改变[43]。在胶质瘤细胞中，用GW4869药理学抑制中性鞘磷脂酶活性可减少EGFR掺入EVs[38]。单EV水平分析进一步表明，EGFR表达高且均匀的胶质母细胞瘤细胞释放异质性EV群体，其中只有一部分含有可检测的EGFR[38]。
其他致癌通路也影响EV产生，尽管其效应在幅度和机制上有所不同。在乳腺上皮细胞中，不同致癌基因的强制表达对EV释放和组成产生不同影响。MYC和AURKB引起特别高水平的EV释放，其中MYC依赖性囊泡形成与神经酰胺代谢密切相关，而AURKB依赖性释放显示出对ESCRT机制的强烈依赖[45]。在同一研究中，单个致癌基因选择性改变EV蛋白组成，并在一些肿瘤细胞中观察到MYC上调与RAS/MEK/ERK通路激活之间的反比关系，进一步说明不同致癌驱动因子可差异性影响EV产生和货物[45]。
EV介导的肿瘤微环境内通讯不仅限于致癌驱动因子本身的转移。不同癌细胞群体之间的EV交换[46]，或被非转化受体摄取[47]，可能在没有典型致癌驱动因子稳定转移的情况下调节肿瘤表型。通讯也以相反方向发生，即从基质细胞到癌细胞。内皮细胞来源的EVs[48]和星形胶质细胞来源的EVs[49]可改变肿瘤细胞信号传导；值得注意的是，星形胶质细胞EV相关的miR-19a下调转移至脑的乳腺癌细胞中的PTEN[49]。内皮EVs同样可诱导前神经胶质瘤细胞发生间充质变化[48]。成纤维细胞分泌的外泌体可通过Wnt–PCP信号传导促进乳腺癌细胞运动；在受体癌细胞内的运输促进肿瘤细胞来源的Wnt11与这些成纤维细胞来源的外泌体结合[50]。
总之，这些发现确立了EV作为非细胞自主致癌信号传导以及肿瘤与基质区室之间双向通讯的介质。水平致癌转移是该过程的一个组成部分：EVs可在细胞间传递功能性致癌物质，而其他EV介导的信号可改变肿瘤和基质群体的行为，并有助于局部肿瘤微环境的重塑。
除了这些对肿瘤和基质细胞的局部和区域效应外，EV介导的通讯还扩展到全身水平，肿瘤来源的囊泡可影响远处器官并促进转移进展。癌症是一种以副肿瘤性改变和转移性播散为特征的全身性疾病[51]，肿瘤来源的EVs可促进这些过程。
开创性研究表明，黑色素瘤来源的EVs调理骨髓来源细胞和远处组织，以促进转移性定植并有助于前转移生态位的建立[40]。胰腺癌来源的外泌体提供了远处部位细胞外基质重塑的进一步例子：它们被Kupffer细胞摄取后促进肝星状细胞分泌TGF-β和纤连蛋白，有助于肝前转移生态位的形成[52]。后续工作将特定的外泌体整合素与器官特异性转移趋向性联系起来，α6β4和α6β1与肺转移相关，αvβ5与肝转移相关[6]。最近，全身性sEV介导通讯被证明涉及远处部位宿主细胞：肺前血栓生态位中CXCL13重编程的间质巨噬细胞释放含整合素-β2的sEVs，促进血栓形成和转移进展[7]。总之，这些研究说明癌症相关EV通讯如何重塑远处组织并影响转移进展。
这些效应并非一致地促进转移。来自低转移性黑色素瘤细胞的外泌体可通过促进抗肿瘤免疫监视来限制转移性播散[53]。在另一种情况下，EV相关的基因组DNA可刺激肝脏中的先天免疫反应，从而限制转移性定植[54]。因此，EVs可促进或抑制转移，具体取决于其货物和受体组织的细胞背景。
许多这些全身性反应的介质，包括趋化因子、凝血因子和整合素，本身不是致癌驱动因子，而是在致癌转化下游起作用。由于致癌驱动因子同时调控EV谱系[36]和癌症相关可溶性介质的表达[55]，致癌转化可在多个水平影响EV介导通讯，从囊泡产生和货物组成到局部细胞间转移和全身性反应。这些观察将EV生物发生和货物调控与致癌信号传导和细胞应激反应联系起来。
如第3节所讨论，TCTP提供了sEV信号传导与肿瘤相关生长之间的实验定义联系，尤其是在水平转移模型中。通过调节囊泡分泌和货物含量，TCTP调节sEV介导的促肿瘤通讯，补充TCTP胜任的sEVs可挽救与TCTP耗竭相关的生长缺陷[2]（图2）。总之，这些发现将TCTP确定为sEV生物学的调控因子，并将TCTP依赖性sEV信号传导置于癌症EV介导通讯的更广泛框架内。
5 知识空白与未来方向
一个仍未解决且从前述各节中显现的问题是：EV异质性是否具有功能后果，如果是，这些差异如何塑造生物学反应。Bulk分析描述了EV制剂的总组成，但无法确定货物如何在单个囊泡之间分布。对单个EV和细胞外颗粒的分析已揭示所选癌症相关分子的异质性分布[56]。如上述胶质母细胞瘤模型所示，均匀表达致癌EGFR的胶质母细胞瘤细胞产生含有或不含可检测EGFR的sEV群体。这些群体的综合生物学效应仍不清楚，它们在亲代癌细胞分子环境中产生的各自通路也尚不明确[38]。更广泛地说，仍待确定不同EV群体是否靶向不同受体细胞、是协同还是竞争作用，以及它们的效应如何与可溶性介质和直接细胞–细胞或细胞–基质相互作用交叉。
p53–TSAP6/STEAP3–TCTP通路提出了一个相关但不同的问题集。TCTP耗竭在具有不同p53背景的肿瘤模型中减少自发sEV释放并降低所释放囊泡的蛋白质和RNA含量[2]。目前尚不清楚这些定量和组成变化是类似地影响所有释放的囊泡，还是反映对特定EV群体的选择性效应；TCTP通过哪些囊泡生物发生和货物装载步骤起作用；以及不同的TP53改变如何在人类肿瘤中影响这些过程。解决这些问题需要对候选调控通路进行扰动，结合单EV水平分析和对定义EV群体的功能测试。当前方法可以分析单个囊泡上的选定标记物或分子特征，但将这些测量与囊泡来源、货物传递和生物学效应联系起来仍然困难[57,58]。
这些未解决的问题也对生物标志物开发有影响。STEAP3属于健康个体循环血浆sEVs中鉴定的保守蛋白组，为疾病相关变化的研究提供生理参考[1]。它在正常循环谱中的存在表明诊断信息不太可能仅在于STEAP3检测，而可能取决于定量变化或其在定义EV群体中与其他标志物的关联。ExoDx前列腺智能评分（ExoDx Prostate IntelliScore）通过整合尿液外泌体中的PCA3、ERG和SPDEF RNA测量来估计初次活检时高级别前列腺癌的风险，说明了这种组合方法[59]。
在治疗上，可以考虑两种互补策略。细胞来源的EVs可通过操作供体细胞或通过将治疗性货物装载到分离的囊泡中进行修饰。在一项临床前研究中，来源于成纤维细胞样间充质细胞的工程化外泌体可携带靶向KRAS^G12D的siRNA或shRNA，并在小鼠模型中抑制胰腺癌[60]。相反，病理性的EV介导通讯可能通过干扰囊泡生物发生、货物装载、释放、结合或摄取而减弱[9,61]。一个关键挑战是选择性，因为相同过程也支持生理性细胞间通讯。因此，优先事项是识别疾病相关的EV群体及其调控节点，而非不加选择地抑制EV介导通讯。舍曲林在上述模型中的效应为测试药理学靶向TCTP是否能改变人类癌症中肿瘤相关EV通讯提供了基础[2]。
更广泛的问题因此是：EV产生、组成和递送的变化如何转化为生物学反应。结果取决于供体细胞的状态、释放的囊泡以及受体细胞的生物学背景。本综述中检查的通路说明了若干实验定义的通路，通过这些通路，细胞内应激和致癌信号可影响EV产生、货物组成和细胞间信息传递，但不意味着任何单一通路代表EV生物发生或功能的普遍机制。进一步进展将取决于建立EV调控通路、EV货物和受体细胞反应之间的因果关系。从这个角度来看，肿瘤通讯可以被视为供体细胞、细胞外囊泡和受体组织之间的受调控相互作用，而不是癌症细胞本身的属性。
