《Calcified Tissue International》：Low Prevalence of Exploratory Biochemical Patterns Compatible with Osteomalacia in a Large Cohort of Participants with Low Serum 25-Hydroxyvitamin D Levels
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摘要专业翻译
维生素D缺乏的阈值主要基于预防骨软化症（osteomalacia）而设定。骨软化症通过骨活检确诊，但也可能通过生化指标识别。本研究旨在探讨低维生素D状态人群中符合骨软化症的探索性生化模式的患病率，以及维生素D补充对生化参数的影响。本研究为横断面研
摘要专业翻译
维生素D缺乏的阈值主要基于预防骨软化症（osteomalacia）而设定。骨软化症通过骨活检确诊，但也可能通过生化指标识别。本研究旨在探讨低维生素D状态人群中符合骨软化症的探索性生化模式的患病率，以及维生素D补充对生化参数的影响。本研究为横断面研究，随后进行随机对照试验（试验注册号：NCT02750293）。受试者招募自基于人群的Troms?研究。研究人员检测了血浆甲状旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）、血清钙、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）和骨特异性碱性磷酸酶（bone-specific alkaline phosphatase, BALP）。横断面部分共纳入423名受试者，382人完成了随机对照试验（194人接受维生素D治疗，方案为负荷剂量100,000 IU后每周20,000 IU持续四个月；188人接受安慰剂）。该队列血清25-羟基维生素D（25-hydroxyvitamin D, 25OHD）平均水平为34 nmol/L。没有任何受试者同时出现血清甲状旁腺激素升高（高于参考范围）、碱性磷酸酶升高和血清钙降低（低于参考范围）的组合。采用最宽松的探索性生化模式时，患病率为8.3%。在干预研究中，与安慰剂组相比，维生素D显著降低了血浆甲状旁腺激素和碱性磷酸酶水平，并提高了血清钙水平。结论：所探索的符合骨软化症的生化模式患病率较低，且强烈依赖于所采用的分析阈值。由于缺乏与骨组织形态计量学（bone histomorphometry）的对照验证，这些发现无法确定骨软化症的患病率，也无法确立合适的血清25OHD阈值。
论文解读
一、研究背景与研究目的
维生素D的核心生理功能是促进肠道钙吸收，钙对于骨骼健康至关重要。儿童维生素D缺乏可导致佝偻病，成人则可导致骨软化症。2011年美国医学研究所（Institute of Medicine, IOM）制定成人维生素D摄入推荐量时，主要依据血清25-羟基维生素D（25-hydroxyvitamin D, 25OHD）水平与骨软化症之间的关系。该依据源自Priemel等人的研究，该研究对675名受试者进行了死后髂嵴骨活检，以骨样组织体积百分比（osteoid volume/bone volume, OV/BV）>2%作为骨软化症的组织学诊断标准，IOM据此推断血清25OHD水平达到50 nmol/L可保护97.5%的人群免于骨软化症。
然而，自Priemel研究之后，再无类似的大规模骨软化症与血清25OHD关系的研究发表。主要原因在于骨软化症的确诊需要骨活检，这是一种侵入性操作，在纯研究环境中存在伦理问题。因此，学者们提出了通过生化指标诊断骨软化症的标准。骨软化症发展过程中存在特征性的生化模式：初期血清钙仅轻度降低且通常在正常范围内，而甲状旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）水平受影响更明显，常高于参考范围；随着病情进展，血清钙进一步下降，PTH和ALP继续升高。但正如Nordin早在1980年所指出的，没有任何单一生化变量能够持续异常且对疾病具有特异性，只有综合多个变量才能做出强有力的推定诊断。
既往有两项利用常规临床实验室数据估计生化骨软化症患病率的研究：新西兰研究纳入32,386名受试者，生化骨软化症患病率为0.05%，临床确诊率为0.02%；苏格兰研究纳入25,379名受试者，相应频率分别为0.5%和0.1%。这两项研究均采用较严格的标准，即血清PTH和ALP高于参考范围且血清钙低于参考范围0.1–0.2 mmol/L。
本研究的研究者此前在Troms?开展了一项横断面研究及为期四个月的维生素D干预研究，纳入455名基线血清25OHD平均水平为34 nmol/L的受试者。按照IOM设定的50 nmol/L血清25OHD阈值，该队列中应有相当数量的受试者患有骨软化症。因此，该队列适合检验不同探索性生化模式与血清25OHD水平的关系，以验证或质疑IOM所设阈值的合理性。此外，如果提示骨软化症的生化改变确实由维生素D缺乏引起，那么随机分配到维生素D组的受试者应观察到这些改变的逆转，这将为生化骨软化症的概念提供支持。
二、研究设计与方法
本研究为横断面研究联合随机对照试验（试验注册号：NCT02750293）。受试者招募自2015/2016年开展的第七次Troms?研究调查，该调查中20,922名受试者成功测定了血清25OHD。血清25OHD低于第10百分位数（<42 nmol/L）且年龄小于80岁的受试者被邀请参加（n=1489），639人响应并接受电话筛选，455人参加基线访视，其中422人被随机分配至维生素D组（负荷剂量100,000 IU胆钙化醇后每周20,000 IU）或外观相同的安慰剂组，持续四个月。最终382人完成试验（维生素D组194人，安慰剂组188人）。
研究检测了空腹状态下的血清钙（参考范围2.15–2.55 mmol/L）、血清磷酸盐、估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate, eGFR）、血清天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, ASAT）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALAT）、血清ALP（参考范围35–105 U/L）、促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）和游离甲状腺素（free thyroxine, FT4）。PTH采用罗氏Cobas 6000 E601平台电化学发光免疫分析法测定。骨特异性碱性磷酸酶（bone-specific alkaline phosphatase, BALP）采用DiaSorin公司的Liaison XL化学发光免疫分析法测定（参考范围5.5–25 μg/L）。血清25OHD采用实验室自建的液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）方法检测，可同时检测25OHD3和25OHD2。血清钙、ASAT或ALAT高于参考范围、甲状腺功能异常或eGFR<60 mL/min/1.73 m2的受试者被排除。
研究者设定了12种探索性生化骨软化症模式，涵盖不同的PTH阈值（参考范围上限、6.0 pmol/L、5.3 pmol/L）、ALP阈值（参考范围上限105 U/L、任意设定的85 U/L）和BALP阈值（参考范围上限25 μg/L、任意设定的20 μg/L），部分模式要求血清钙低于参考范围。此外，研究者还创建了PTH×ALP的替代变量用于评估与血清25OHD的关系。
三、研究结果
横断面研究结果
453名基线受试者中有完整数据，排除高钙血症3人、甲状腺功能异常2人、eGFR<60 mL/min/1.73 m2者3人、肝转氨酶升高者22人后，423人（191名女性，232名男性）纳入横断面分析，平均血清25OHD水平为34 nmol/L。
在423名受试者中，134人（31.7%）血浆PTH高于参考范围（>6.8或7.5 pmol/L），237人（56.0%）PTH>6.0 pmol/L，309人（73.0%）PTH>5.3 pmol/L。15人（3.5%）血清钙<2.15 mmol/L，11人（2.6%）血清ALP>105 U/L。将ALP阈值降至85 U/L后，45人（10.6%）水平升高。2人血清BALP高于参考范围，9人血清BALP>20 μg/L。
符合骨软化症探索性生化模式的受试者数量高度依赖于所采用的阈值：没有任何受试者同时出现高血浆PTH、高血清ALP（或BALP）和低血清钙的组合；仅4人（0.9%）同时出现高血浆PTH和高血清ALP；18人（4.3%）同时出现高血浆PTH和血清ALP>85 U/L；采用最宽松的标准（血浆PTH>5.3 pmol/L且血清ALP>85 U/L）时，35人（8.3%）符合骨软化症探索性生化模式。
PTH×ALP替代变量与血清25OHD显著相关（rho=?0.158，P=0.001），但未显示出明确的25OHD截断值。
干预研究结果
382名完成试验的受试者中，与安慰剂组相比，维生素D组在干预结束时血浆PTH、血清ALP和BALP显著降低，血清钙显著升高。安慰剂组各变量在基线和研究结束值之间表现出高度追踪性，血浆PTH、血清ALP、BALP、钙和25OHD的Spearman相关系数分别为0.69、0.92、0.88、0.64和0.40（P<0.001）。
四、讨论与结论
研究者发现，在血清25OHD水平较低的队列中，符合骨软化症探索性生化模式的患病率似乎较低，这与Priemel等人研究中预期的骨软化症患病率存在明显差异。研究者通过分析Priemel等人发表的散点图估计，血清25OHD在25–125 nmol/L范围内的约300名受试者中约有43人（14.3%）被诊断为骨软化症，据此推算本队列应有约60人患骨软化症，但即使采用最宽松的生化标准也仅识别出35人。
研究者指出，Priemel等人的研究存在多个可能的问题，包括骨软化症组织学标准设定过低（OV/BV>2%）。健康人群的OV/BV平均值接近3%（标准差约1.5%），正常上限应接近5%。若将骨软化症诊断阈值提高至OV/BV>5%，Priemel数据中血清25OHD在25–125 nmol/L范围内仅有约7人（2.3%）符合骨软化症诊断，对应本队列约10人。然而，采用标准的生化骨软化症标准（PTH和ALP升高且血钙降低）时，本队列未发现任何受试者符合，这可能提示标准生化骨软化症标准过于严格。
研究者认为，由于血清钙和磷酸盐对骨软化症的检测敏感性较低，且早期诊断骨软化症对于防止不可逆改变至关重要，因此不应将钙和磷酸盐纳入潜在的生化骨软化症标准。血浆PTH作为钙状态的指标远比血清钙敏感，因为参考范围内的微小血钙下降即可引起PTH的显著代偿性升高。研究者建议血浆PTH和血清ALP作为生化骨软化症诊断的候选标志物，但需经骨组织形态计量学验证。干预研究中维生素D对PTH和ALP的显著降低效应及其高度追踪性支持了这些指标作为候选标志物的作用，但效应幅度较小，可能仅是维生素D的生理效应而非骨软化症逆转的特异性表现。
研究者强调，本研究的局限性包括未进行骨活检、分析未预先设定而属探索性、未记录钙摄入量、测量的是总钙而非离子钙、排除了高钙血症、肾功能损害、甲状腺功能障碍和转氨酶升高者可能降低了患病率估计。研究结论认为，在血清25OHD水平较低的队列中，符合骨软化症探索性生化模式的患病率较低且高度依赖于分析阈值。由于缺乏骨活检对照，这些发现不能确定骨软化症的实际患病率，也不能确立合适的血清25OHD阈值。未来需要开展大规模骨活检研究，将骨软化症的组织学诊断与血清25OHD水平及其他钙代谢标志物进行关联验证。
