β-半乳糖苷酶激活型双臂与三臂自降解交联剂的设计与合成

《Results in Chemistry》：Synthesis of di-arm and tri-arm β-galactoside-crosslinkers

　　

糖苷水解酶等酶类已被用于掩蔽前药的特定激活，通过电子级联反应在激活后释放活性药物。开发适用于可降解聚合物系统的糖苷酶激活型结构设计仍是一项尚未解决的研究挑战。本文描述了首例糖苷酶激活型多臂交联剂的设计与合成，并提出将其应用于可激活聚合物体系的构建，该类体系被设计为在酶促激活后发生降解。多种糖苷酶（包括β-半乳糖苷酶（β-galactosidase））在多种肿瘤类型中表达上调，而在健康细胞中表达水平显著较低。这一特性此前已被用于开发糖苷酶激活型前药，该类前药由细胞毒性抗癌药物通过自降解连接子与糖掩蔽基团偶联而成，使得糖苷键经酶切后释放活性药物。定向酶疗法（如抗体导向酶前药疗法（ADEPT））通过施用酶-抗体偶联物实现肿瘤细胞表面积累，同样利用可裂解掩蔽基团实现靶向治疗递送。自降解聚合物（self-immolative polymers）是一类新兴的响应性聚合物，能在外部刺激下发生解聚和降解，其应用已从材料科学扩展到诊断和药物递送等多个领域。与前药策略中掩蔽药物生物活性相关功能基团的原理类似，自降解聚合物采用可特异性移除的裂解基团，在激活后触发聚合物交联剂或主链的断裂。目前，酶促激活的自降解聚合物仍是一个研究不足的领域，仅有少数实例报道。开发酶激活型聚合物有望将这类响应性聚合物拓展至生物学环境，并补充现有的响应性聚合物体系。现有可激活糖聚合物体系主要依赖于大分子多糖和结合于聚合物主链上的单功能侧基糖苷，合成复杂性限制了多臂糖苷交联剂的获取。在本工作中，研究人员设想开发类似于此前用于释放多个药物分子或荧光报告基团的自降解糖苷骨架，并将其应用于多臂交联剂的制备。为此，本文报道了β-半乳糖苷酶激活型交联剂的合成，展示了可靠的糖苷交联剂合成路线，并提议将其未来应用于构建设计为激活后降解的聚合物体系。

研究背景与现存问题

糖苷水解酶（glycosidases）如β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）在多种肿瘤组织中表达上调，而在健康细胞中表达水平显著较低，这一差异已被用于开发糖苷酶激活型前药（prodrugs）。前药通过自降解连接子（self-immolative linker）将细胞毒性药物与糖掩蔽基团偶联，酶切糖苷键后即可释放活性药物。抗体导向酶前药疗法（ADEPT）等定向酶疗法进一步利用酶-抗体偶联物实现肿瘤靶向治疗。然而，将糖苷酶激活机制引入可降解聚合物系统仍是尚未解决的研究挑战。现有可激活糖聚合物系统大多依赖大分子多糖或聚合物主链上的单功能侧基糖苷，合成复杂性和结构局限性阻碍了多臂糖苷交联剂的开发。自降解聚合物虽已在材料科学和药物递送等领域展现潜力，但酶促激活型自降解聚合物的实例极为有限。因此，开发能够响应糖苷酶激活而降解的多臂交联剂，对于拓展响应性聚合物在生物学场景中的应用具有重要意义。

研究内容与结论

本研究首次报道了β-半乳糖苷酶激活型双功能和三功能自降解交联剂的设计与合成。研究人员成功合成了两种双功能交联剂——携带乙烯基（vinyl）的化合物1和携带甲基丙烯酰胺（methacrylamide）的化合物25，以及一种三功能交联剂——化合物2。这些交联剂均基于自降解树枝状骨架（dendritic scaffold），其中双功能交联剂借鉴Shabat团队的双货物释放骨架，三功能交联剂则基于Scheeren团队的三重货物释放骨架。所有目标分子均在糖苷键邻位引入硝基（nitro group）以降低酚羟基的pKa值，从而加速酶切后的自降解速率。研究表明，这些交联剂是首批通过合成获得的小分子多臂糖苷交联剂，专门设计用于响应糖苷酶激活，也是首个可用于三重货物释放的糖缀合物（glycoconjugate）。该工作为材料科学家和化学生物学家提供了可激活聚合物领域的扩展工具包，预期这些交联剂可应用于多种聚合方法，生成能够在时空控制下被β-半乳糖苷酶降解的生物聚合物。

关键技术与方法

研究采用的主要关键技术包括：（1）相转移催化（phase transfer catalysis）糖苷化反应，以弱亲核性的酚类受体与失活糖苷供体进行偶联；（2）Gabriel胺合成法（Gabriel amine synthesis）制备含乙烯基聚合官能团的胺类单体；（3）碳酸酯活化与HOBt介导的偶联策略，将自降解树枝状骨架与糖苷模块及聚合基团逐级组装；（4）碱性甲醇溶液脱乙酰保护。所有中间体和终产物均通过柱层析纯化，产率经分离计算。

研究结果

双功能交联剂的合成

研究人员首先合成了中心构建块7：以1,3-亚苯基二甲醇（13）为起始原料，经TBS保护、硝化、Pd/C还原硝基及TBAF脱保护四步得到化合物7，总收率约36%。同时通过Gabriel胺合成法制备了乙烯基苄胺6。随后，全乙酰化半乳糖（3）经溴化得半乳糖溴化物19，再与4-羟基-3-硝基苯甲醛（4）在相转移催化条件下偶联得糖苷20（收率48%）。醛基经NaBH?还原得醇21（86%），再经4-硝基苯基氯甲酸酯（5）活化得碳酸酯22（96%）。化合物22与构建块7在HOBt作用下偶联得23（46%），再次活化得二碳酸酯24（70%）。最后，24分别与乙烯基苄胺6或商品化甲基丙烯酰胺10偶联，并经5 mM NaOH脱乙酰保护，分别得到目标交联剂1（两步总收率35%）和25（两步总收率42%）。

三功能交联剂的合成

三功能构建块11的合成：以1,3,5-三羟甲基苯（12）为起始，经TBS保护（定量）、硝化（47%）、Pd/C还原（55%）及TBAF脱保护（46%）四步制得。随后，半乳糖苷碳酸酯22与三醇11在HOBt作用下偶联得化合物29（34%），再经4-硝基苯基氯甲酸酯活化得三碳酸酯30（46%）。最后，30与甲基丙烯酰胺10偶联并经5 mM NaOH脱保护，得到三功能交联剂2（两步总收率21%）。这是首个利用de Groot等人报道的三重货物释放树枝状骨架合成的糖苷类可聚合化合物。

结论与意义

本研究首次报道了三种β-半乳糖苷酶激活型多臂交联剂的合成路线，包括两个双功能交联剂（1和25）和一个三功能交联剂（2）。这些交联剂是首批通过合成获得的小分子多臂糖苷交联剂，专门设计用于响应糖苷酶激活，同时也是首个可实现三重货物释放的糖缀合物。该工作为可激活聚合物领域提供了新的化学工具，预期这些交联剂可通过不同聚合方法生成能够在时空控制下被β-半乳糖苷酶降解的生物聚合物，从而拓展响应性聚合物在生物医学中的应用前景。