《Nature Neuroscience》：Massively parallel assessment of gene regulatory activity at human cortical-structure-associated variants
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遗传关联研究已识别出数百个主要位于非编码区域、与人类皮层结构个体差异相关的位点，但其贡献表型的具体功能变异未知。研究人员采用大规模并行报告基因 assay（massively parallel reporter assay，MPRA），在原代人类神经前体细胞（
遗传关联研究已识别出数百个主要位于非编码区域、与人类皮层结构个体差异相关的位点，但其贡献表型的具体功能变异未知。研究人员采用大规模并行报告基因 assay（massively parallel reporter assay，MPRA），在原代人类神经前体细胞（primary human neural progenitor cells，phNPCs）中于基线及 Wnt 刺激下测量 9,092 个皮层结构相关变异的调控活性。研究人员从 150 个皮层结构相关位点（占研究位点的 76%）中鉴定出 918 个具调控潜能的变异，其中超过 50% 显示等位基因效应。Wnt 刺激改变部分位点的调控活性，揭示条件依赖性增强子。MPRA 活性主要由 Alu 元件诱导，提示其参与皮层扩张。基序破坏变异的区域特异性影响可能由发育中空间定位的转录因子（transcription factor，TF）表达介导。上述结果提供了理解非编码变异如何影响皮层结构的基因组尺度功能框架。
研究背景方面，相对于非人灵长类，人类大脑皮层的扩张被认为有助于形成独特的认知与社会能力。包括 ENIGMA（Enhancing Neuroimaging Genetics through Meta-analysis）在内的遗传关联研究，已通过磁共振成像识别出与皮层表面积（surface area，SA）和厚度（thickness，TH）个体差异相关的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs）。然而，大多数皮层结构相关变异位于非编码区，功能不明。已有证据表明，这些关联富集于原代人类神经前体细胞（primary human neural progenitor cells，phNPCs）的调控区，并与染色质可及性/表达数量性状位点（chromatin accessibility/expression quantitative trait loci，ca/eQTLs）共定位，提示变异可能通过改变 TF 结合与基因表达，在产前发育中影响前体细胞命运，最终导致成年皮层结构差异。TF 具有区域特异性表达，并可在 Wnt 等发育信号通路激活时转位入核，因此变异可能在不同区域或刺激条件下产生不同效应。由于连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD），关联位点中真正具有调控活性的变异尚不清楚。该研究即在此背景下开展。
论文发表在《Nature Neuroscience》。研究人员实施大规模并行报告基因 assay（massively parallel reporter assay，MPRA），在 phNPCs 中检测 9,092 个皮层结构相关变异的调控活性与等位基因效应，并在 Wnt 刺激条件下评估条件依赖性调控。结论为：150 个相关位点中 76% 含具调控潜能元件，超过半数变异具等位基因效应；MPRA 活性主要由 Alu 元件驱动；Wnt 刺激揭示条件依赖性增强子；TF 表达空间分布可解释变异的区域特异性效应。该研究为皮层结构非编码变异提供了基因组尺度功能注释框架。
主要关键技术方法方面，研究人员使用 ENIGMA 全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）来源的样本位点，并在原代人类神经前体细胞（phNPCs）中开展基线对照与 CHIR99021 激活 Wnt 信号后的 MPRA；以 502 个 caQTLs 作功能参照、194 个打乱序列作阴性对照、常用启动子作阳性对照；通过条形码 RNA 测序与 DNA 测序计算转录速率表征调控活性；利用 BrainSpan Atlas 产前表达数据做区域 TF 表达关联；以染色质构象（Hi-C）和 CUT&RUN 等注释靶基因与内源 Alu 活性；对条件依赖性变异用 CRISPR 干扰（CRISPR interference，CRISPRi）验证。
研究结果如下。MPRA design and reproducibility：研究人员设计四组 150-bp 元件，在 16 个生物重复 phNPCs 中转染池化 MPRA 文库，基线用 DMSO、Wnt 条件用 CHIR99021；生物学重复间 MPRA 活性高度相关，阳性对照高于阴性对照，说明 assay 可重复，且 caQTLs 与 MPRA 等位基因效应重叠有限，MPRA 活性是检出等位基因效应的最强预测因子。
Identifying regulatory elements associated with interindividual differences in human cortical structure：研究人员在 198 个 ENIGMA 位点中检出 988 个车辆条件下显著活跃的元件，70% 位点至少含一个活跃元件；386 个变异具显著等位基因效应即表达调控变异（expression-modulating variants，emVars），多数位点至少一个 emVar，且 MPRA 活跃元件多具区域局限效应。
Cortical-structure-associated MPRA active elements are enriched in Alu elements：研究人员发现活跃元件富集于短散在核元件（short interspersed nuclear elements，SINEs），尤其是正向 Alu 元件；A box 与 B box 所在的左臂 Pol Ⅲ 启动子序列驱动最高活性，年轻 Alu（milliDiv 低）活性更高；TFIIIC 结合与 eRNA/uaRNA 富集支持其在 phNPCs 内源基因组中的功能角色。
TFs contributing to regulatory function at cortical-structure-associated elements：研究人员发现活跃元件序列复杂度更高且更多含 TF 结合基序，ZNF135/460、MEF2A-D、Zfx 簇富集；基序破坏程度与 emVars 等位基因效应强相关，RARA、ZNF135、NR2F1 等基序破坏对 MPRA 活性影响最大。
Spatial relationships between TF expression and allelic effects：研究人员将 emVars 破坏的 TF 基序与 BrainSpan 8–24 孕周 16 个宏观皮层区 TF 表达关联，发现 RARG 等 TF 区域高表达与对应变异的 SA 效应方向一致，说明区域 TF 表达水平可调制变异对皮层结构的区域影响。
Wnt activity modulating MPRA activity：研究人员在 CHIR 刺激下检出类似比例活跃元件，657 个两条件共有；32 个元件 Wnt 下活性更高、7 个车辆下更高；Wnt 高活性元件更多重叠 SINEs，且条件依赖性活跃元件所连基因在刺激下表达也升高，提示条件依赖性增强子。
Condition-dependent regulation of gene expression：研究人员将活跃元件通过启动子或 Hi-C 互作连到靶基因，发现 Wnt 高活性元件连到刺激上调整合基因，如 rs4670759 位于 CDC42EP3 启动子，Wnt 下 MPRA 活性与染色质可及性增加，并破坏 PLAGL2 基序，PLAGL2 在 CHIR 后上调。
Condition-dependent allelic effects at cortical-structure-associated loci：研究人员发现部分 emVars 仅单条件存在，交互检验得 12 个条件依赖性 emVars；这些变异未破坏 TCF/LEF 基序，但所破坏 TF 在 Wnt 后差异表达。rs273576 在 DCDC1 内含子，Wnt 减弱等位效应；rs2802295 在 FOXO3 内含子，Wnt 下等位效应明显，CRISPRi 沉默该元件降低 FOXO3 表达，实验性地把皮层 SA 相关 emVar 连到靶基因。
讨论部分总结：研究人员指出，大多数皮层结构相关位点在 phNPCs 中含具调控活性的元件，非编码变异通过改变调控活性影响发育与成人皮层结构；MPRA 可排除个体内其他变异混淆，直接分离高 LD 等位片段。破坏 TF 基序的变异提示 RARA、RARG、ZNF135、NR2F1 等是关键调控因子；区域效应可由对应 TF 的区域表达解释。Wnt 信号使部分变异呈条件依赖性调控，说明发育信号通路可重塑遗传变异的调控潜能。
研究结论部分翻译：在该研究中，研究人员评估了 phNPCs 中皮层结构相关变异的基因调控潜能。研究发现，大多数皮层结构相关位点含有在 phNPCs 中具有调控活性的元件，且皮层结构相关遗传变异会影响该调控活性水平。既往基于脑组织和 phNPCs 群体内源变异的 QTL 研究同样表明，遗传变异在产前发育中发挥作用以影响成年皮层结构性状。研究人员的 MPRA 结果通过等位基因的实验操作进一步支持该结论，排除了个体中存在其他变异带来的混杂效应。由于实验操作可分离高 LD 中的等位基因，因此可指认改变基因调控功能的具体遗传变异。那些破坏 TF 结合基序的变异可用于提示导致皮层结构改变的上游调控因子。在该研究中，研究人员发现 RARA、RARG、ZNF135 和 NR2F1 等 TF 是个体间人类皮层结构差异的关键调控因子。尽管其功能主要在小鼠等模型中研究，该发现进一步表明这些 TF 参与人脑发育与结构形成。研究人员还提出皮层结构遗传关联中区域特异性效应的机制：变异的区域效应与其结合 TF 的表达水平相对应。Wnt 信号在非人模型与体外人模型中均已知影响脑发育，因此研究人员推断皮层结构相关变异的调控效应可能随 Wnt 刺激变化。研究发现遗传变异具有 Wnt 刺激依赖的基因调控功能，部分变异作为条件依赖性增强子发挥作用，说明脑发育关键信号通路可影响遗传变异的调控潜能，从而揭示遗传变异如何塑造人脑皮层结构相关差异。
