基于rTCO笼闭的蓝至近红外荧光探针用于点击释放反应监测的研发

《Chemistry – A European Journal》：Development of Blue-to-Near-Infrared rTCO–Caged Fluorogenic Probes for Click-to-Release Monitoring

　　

生物正交点击释放反应为生物系统中功能分子的化学控制激活提供了一种强大策略。本研究报道了一系列12种反式环辛烯（trans-cyclooctene，rTCO）笼闭荧光探针的研发，其中包括11种新化合物，覆盖蓝至近红外光谱区域。研究人员采用不同的探针设计策略，包括直接笼闭、自消除连接子（self-immolative linker，SIL）以及共价组装，评估了这些探针在磺化四嗪（sulfonated tetrazine，SA-Tz）触发剂激活下的荧光开启性能、释放动力学以及在活细胞中的表现。性能最优的探针展现出44倍的荧光开启倍数和1027 M?1 s?1的二级反应速率常数，而部分选定的探针在2分钟内即可产生可检测的细胞内荧光信号，并在约10分钟内达到信号饱和。研究结果揭示了探针在溶液与细胞环境中行为的重要差异，凸显了在预期生物学背景下评估荧光点击释放探针的必要性。本研究拓展了用于监测四嗪触发生物正交释放反应的可用工具库，并筛选出具有细胞应用前景的候选探针。

论文解读：蓝至近红外rTCO笼闭荧光探针的研发及其在点击释放监测中的应用

一、研究背景与问题提出

生物正交化学中的点击释放反应（click-to-release）是近年来发展迅速的一种化学调控策略，其核心在于利用反式环辛烯（trans-cyclooctene，rTCO）笼闭分子与1,2,4,5-四嗪（tetrazine，Tz）之间的逆电子需求Diels–Alder（inverse electron-demand Diels–Alder，IEDDA）反应，触发笼闭基团的裂解，从而释放功能性货物分子。该反应由Robillard率先报道，通过烯丙位修饰氨基甲酸酯基团的rTCO（即释放型TCO，release-TCO，rTCO）与四嗪反应后，经消除和互变异构步骤最终释放货物分子。由于该反应具有快速、完全、生物正交等优点，已进入临床试验阶段，展现出显著的转化应用潜力。

荧光发生化合物（fluorogenic compounds）在监测点击释放反应进程中发挥了关键作用。这类探针从初始淬灭的前体状态转变为产生荧光信号的状态，可作为实用工具用于监测反应进程并优化整个释放过程。然而，目前有效的荧光发生探针种类仍然相对有限。最常见的构建策略是对染料分子中共振结构所必需的功能基团（通常为氨基或醇羟基）进行笼闭。典型的例子包括rTCO笼闭的氨基香豆素（CoumNH₂-rTCO）以及利用自消除连接子（self-immolative linker，SIL）阻断染料酚羟基的探针（如Reso-rTCO）。此外，van Kasteren团队开发了含有荧光团-淬灭剂对的双功能化可裂解cTCO探针。然而，这些探针大多覆盖较窄的光谱范围，限制了其更广泛的应用。更为关键的是，不同设计原理对rTCO笼闭荧光团在生物系统中的整体性能影响尚不明确。因此，开展系统性的探针设计、合成与评估研究，拓展蓝至近红外（near-infrared，NIR）光谱区域的荧光发生点击释放探针库，具有重要的科学意义和应用价值。

二、研究内容与主要结论

针对上述问题，研究人员开展了一项系统性研究，设计、合成并评估了一系列12种覆盖蓝至近红外光谱区域的rTCO笼闭荧光探针，其中包括11种新化合物。研究采用了三种不同的探针设计原理：其一，将笼闭rTCO基团直接连接至染料共轭体系中不可或缺的功能部分（如罗丹明的氨基）；其二，通过自消除连接子（SIL）阻断酚羟基；其三，采用"共价组装"（covalent assembly）策略，即荧光染料在点击释放过程后通过合适前体染料（pro-dye）的分子内环化原位合成，从而避免淬灭探针残留荧光信号的干扰。

所有探针均采用氨基甲酸酯基团作为连接方式，以避免细胞内酯酶可能引起的非特异性酯键断裂以及合成上具有挑战性的rTCO笼闭醚类化合物的缓慢释放问题。研究人员使用此前已证明能实现快速完全释放的双酚对硝基苯酚磺酰胺四嗪（SA-Tz）作为触发剂，在20% DMSO/PBS（pH=7.4）溶液中评估了各探针的荧光开启倍数和反应动力学。在溶液实验中，磺化醌菁染料探针（SQCy7-rTCO，化合物10）展现出最高的44倍荧光开启响应，其次为试卤灵探针（Reso-rTCO，化合物9）的27倍和罗丹醇探针（Rhodol-rTCO，化合物8）的25倍。二级反应速率常数方面，化合物10、9和11表现最快，k₂值分别为1027、836和817 M^?1s^?1，而双笼闭前体的释放速率慢约一至两个数量级。12种探针的观测速率跨越三个数量级，反映了设计差异。

在活细胞实验中，研究人员将探针加入HeLa细胞（终浓度5 μM，孵育30分钟），洗涤后加入10 μM SA-Tz继续孵育1.5小时，通过共聚焦显微镜观察。结果显示，化合物2（亚胺香豆素）、4（双笼闭荧光素）、7（吡咯宁前体）、8（罗丹醇）和9（试卤灵）在细胞内展现出清晰的荧光信号，而化合物1（香豆素）、10–12（磺化醌菁和半菁类探针）以及3、5、6未观察到明显信号，可能归因于两性离子特性导致的细胞通透性差或洗涤过程中的探针流失。进一步的细胞内时间序列研究表明，化合物2和7在2分钟内即可产生可检测的细胞内荧光信号，化合物8在约4分钟后显现信号，所有测试化合物的荧光信号在约10分钟内达到饱和。值得注意的是，化合物7在溶液中的吡咯宁释放速率相对较慢（k₂=22.7 M^?1s^?1），但在细胞中却表现出快速且强烈的响应，这一差异进一步表明探针在活细胞中的性能并非仅由简化条件下的释放动力学决定。

三、关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：有机合成方法制备rTCO笼闭荧光探针，包括Boc保护的咪唑鎓活化DMEDA试剂酰化、rTCO-NHS酯偶联、Knoevenagel丙二腈缩合等合成路线；荧光光谱法测定荧光开启倍数和反应动力学，通过监测反应过程中荧光信号随时间变化计算观测一级速率常数（k_obs）并推导二级速率常数（k₂）；共聚焦显微镜活细胞成像技术评估细胞内点击释放反应，包括静态成像和动态时间序列成像；以及不同细胞系（HeLa宫颈癌细胞、A549肺癌细胞、HCT116结直肠癌细胞）中的验证实验。

四、研究结果

2.1 荧光探针的设计与合成

研究人员基于三种设计原理制备了12种探针。第一种为直接笼闭策略，将rTCO基团直接连接至染料共轭体系中的关键氨基（如罗丹明探针5和6）。第二种为自消除连接子策略，通过DMEDA间隔基将rTCO连接至染料酚羟基（如香豆素探针1、荧光素探针3和4、罗丹醇探针8、试卤灵探针9、磺化醌菁探针10）。第三种为共价组装策略，荧光染料在点击释放后通过自发环化原位生成（如亚胺香豆素探针2和吡咯宁探针7）。此外还制备了半菁探针11和12。各释放染料的吸收和发射波长覆盖380–691 nm的吸收范围和462–711 nm的发射范围，实现了蓝至近红外区域的全面覆盖。

2.2 与SA-Tz的点击释放反应

在20% DMSO/PBS溶液中加入SA-Tz后，各探针展现出差异显著的荧光开启响应。化合物10（44倍）、9（27倍）和8（25倍）表现最佳，而单rTCO修饰的罗丹明探针5仅展现1.3倍的荧光开启，表明单一罗丹明氨基的笼闭不足以淬灭其荧光。反应动力学方面，化合物10、9和11的k₂值最高（1027、836和817 M^?1s^?1），双笼闭前体6和4的释放速率慢约一至两个数量级。含DMEDA连接子的酚羟基笼闭探针（1、3、9、10、12）的释放速率差异反映了酚羟基pK_a值的不同。共价组装探针中，化合物2的亚胺香豆素释放较快（k₂=320 M^?1s^?1），而化合物7的吡咯宁释放较慢（k₂=22.7 M^?1s^?1）。

2.3 细胞内点击释放反应

在活HeLa细胞实验中，化合物2、4、7、8和9展现出清晰的细胞内荧光信号，表明这些探针能够有效进入细胞并被SA-Tz触发释放荧光团。化合物1（香豆素）未观察到信号，可能与其最蓝移的吸收发射特性有关。化合物10–12未显示信号，可能因两性离子特性导致细胞通透性差。化合物3、5、6在细胞中表现不佳，尽管它们在笼闭形式下不带电荷，研究人员推测可能是在孵育后的洗涤步骤中被更有效地从细胞中去除。化合物2在A549和HCT116细胞系中的验证实验进一步确认了其良好性能，表明这些探针可用于不同癌症模型的点击释放监测。

2.4 细胞内时间序列研究

对化合物2、7和8进行的时间序列成像显示，细胞内释放反应对所有测试化合物均十分迅速。化合物2和7在2分钟内即可产生清晰可见的荧光信号，化合物8的信号在约4分钟后显现。所有化合物的荧光信号在约10分钟内达到饱和。这一结果与化合物7在溶液中较慢的释放速率形成鲜明对比，表明细胞内的荧光信号反映的是四嗪连接、点击后互变异构、细胞内环境、探针积累、通透性和稳定性的综合结果，而非仅由固有释放动力学决定。

五、结论与讨论

研究人员通过系统比较不同设计原理的rTCO笼闭荧光探针在溶液和活细胞中的性能，揭示了探针行为在两种环境中的重要差异。溶液中的性能指标（荧光开启倍数和二级速率常数）并不能直接预测细胞内的表现，部分在溶液中表现中等的探针在活细胞中效率较高，而一些体外特性良好的化合物在细胞内响应较弱。这一发现强调了在预期生物学背景下评估荧光点击释放探针的必要性。研究拓展了荧光发生点击释放探针的工具库，筛选出化合物2、7、8和9等具有细胞应用前景的候选探针，其中两种新型共价组装探针在生物正交点击释放化学中的应用为首次报道，可能为该领域未来的发展提供指导。向体内应用转化仍需进一步验证，包括探针稳定性、生物分布、组织穿透、清除和潜在毒性等方面，同时两个反应伙伴向同一组织的高效递送也是重要的考量因素。本研究为荧光发生点击释放探针在更复杂生物模型中的进一步评估奠定了基础。