《Future Journal of Pharmaceutical Sciences》：Rational design of a dual-function, LL-37/HNP-1, chimeric antimicrobial peptide: a broad-spectrum AMP against respiratory co-infections
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背景：呼吸道病毒-细菌共感染目前仍难以治疗，因为现有疗法通常分别针对单一病原体。本研究设计并计算评估了一种双功能嵌合抗菌肽（AMP），该肽整合了LL-37和人中性粒细胞肽-1（HNP-1）的保守抗病毒与抗菌结构域。各结构域通过刚性EAAAK连接肽融合，并进行序
背景：呼吸道病毒-细菌共感染目前仍难以治疗，因为现有疗法通常分别针对单一病原体。本研究设计并计算评估了一种双功能嵌合抗菌肽（AMP），该肽整合了LL-37和人中性粒细胞肽-1（HNP-1）的保守抗病毒与抗菌结构域。各结构域通过刚性EAAAK连接肽融合，并进行序列优化以改善理化性质。方法：利用结构建模和分子动力学模拟，评估了该肽的稳定性、溶解性、构象组织及安全性。优化后的构建体显示出对呼吸道合胞病毒（RSV）和人鼻病毒（hRV）增强的抗病毒活性，以及对肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌改善的预测抗菌活性。结果：结构验证表明其具有有利的α-螺旋和β-折叠组织及改进的模型质量。分子动力学模拟通过分析均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、氢键、回旋半径和溶剂可及表面积（SASA），进一步确认了该肽的稳定性和紧凑性。结论：总体而言，这些计算研究结果凸显了LL-37/HNP-1融合肽作为针对呼吸道共感染的广谱治疗候选物的潜力，未来可应用于吸入式或纳米颗粒递送系统。仍需实验性抗菌测定以验证其生物活性。
论文解读文章
研究背景与问题
呼吸道感染由病毒和细菌病原体共同引起，是全球发病率和死亡率的主要原因，尤其对儿童、老年人及免疫功能受损者威胁巨大。呼吸道合胞病毒（RSV）、人鼻病毒（hRV）和流感病毒是最常见的病毒性病原体，而肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌则是社区获得性肺炎及继发感染的主要细菌性病原体。病毒与细菌的频繁共感染不仅加剧了临床结局的恶化，还增加了对抗生素的依赖，从而加速了抗菌药物耐药性的蔓延。尽管抗病毒和抗生素疗法取得了显著进展，但其有效性仍受限于病原体特异性狭窄、耐药性快速出现以及在混合感染中疗效有限等问题。这些局限性凸显了对具有广谱疗效且耐药风险更低的新型治疗策略的迫切需求。抗菌肽（AMP）作为先天免疫的关键组分，通过破坏微生物膜发挥快速杀菌作用，同时降低耐药性发展可能性，被视为下一代治疗候选物的潜在来源。
研究目的与设计思路
本研究旨在通过理性设计，将LL-37（人源cathelicidin，由CAMP基因编码的hCAP-18活性片段）和HNP-1（人α-防御素原型，由中性粒细胞主要产生）的保守功能结构域整合到单一嵌合肽中。LL-37具有抗病毒和抗菌双重活性，其抗菌效力取决于两亲性、阳离子电荷及保守核心区域；HNP-1则通过三个二硫键稳定结构，兼具直接灭活病毒和破坏细菌膜的活性。研究人员利用NCBI保守结构域数据库（CDD）鉴定出LL-37的抗病毒区域（残基31–131）和抗菌区域（残基137–163），以及HNP-1的单一α-防御素结构域（残基66–94）。这些结构域通过刚性EAAAK连接肽融合，以维持各结构域的结构独立性并减少空间位阻干扰。随后通过靶向突变优化序列，旨在增强结构稳定性、改善理化性质并提升功能活性。
关键技术与方法
研究人员首先从UniProt数据库（登录号P49913和P59665）获取LL-37和HNP-1的氨基酸序列，利用NCBI CDD（版本3.19）鉴定保守功能区域。理化性质通过ExPASy ProtParam工具分析，包括分子量、理论等电点（pI）、不稳定指数、脂肪指数和亲水性平均值（GRAVY）。抗菌潜力通过AntiBP2服务器（版本2.0）基于支持向量机（SVM）分类器预测，抗病毒活性通过VirVACPRED（版本1.0）评估。毒性通过CSM-Toxin服务器预测，溶解性通过SoluProt v1.0评估。二级结构使用JPred4服务器预测，螺旋轮投影通过NetWheels软件生成以分析两亲性。三级结构采用AlphaFold2（经ColabFold实现）预测，并通过SAVES v6.0元服务器（含ERRAT、PROCHECK、Verify3D）和ProSA-web进行质量验证。稳定性增强突变通过CUPSAT工具引入，分子动力学（MD）模拟采用GROMACS 2022软件包和CHARMM36力场，在TIP3P水模型中进行200 ns生产模拟，分析RMSD、RMSF、氢键、回旋半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）。
研究结果
序列检索与保守结构域鉴定：通过NCBI CDD分析，LL-37包含两个不同结构域：覆盖残基31–131的抗病毒区域和覆盖残基137–163的抗菌区域（CAP18_C结构域）；HNP-1则代表单一保守α-防御素结构域（残基66–94），对应其典型抗菌活性。
突变分析：基于CUPSAT预测，研究人员将野生型序列中的SFDIS和DKDNKR区域分别替换为TCRYT和CDKQNK，并将末端QGRLWAFCC替换为GGRKWFWCF。突变后不稳定指数从35.10降至30.12，结构稳定性增强，同时保持有利的溶解性和非毒性。
构建体设计：最终构建体由LL-37抗病毒区域、EAAAK连接肽、HNP-1抗菌结构域及另一EAAAK连接肽和LL-37抗菌区域组成，形成多功能嵌合肽。
理化性质评估：突变优化后，构建体表现出增强的结构稳定性、增加的正电荷和改善的亲水性，同时保持非毒性和高溶解性。
功能预测：突变后所有结构域的预测活性均增强，LL-37抗病毒结构域对RSV和hRV的抗病毒潜力提高，抗菌结构域对肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的抗菌评分改善。
二级结构预测：JPred4预测显示突变后β-折叠区域略有延伸且α-螺旋段稳定化，表明结构紧凑性改善和功能稳定性增强。
螺旋轮预测：NetWheels分析显示突变后疏水（黄色）与极性/碱性（红色）残基分离更清晰，形成更明确的两亲性模式，有利于增强膜相互作用潜力。
三级结构建模与验证：ERRAT质量因子从73.23%（野生型）显著提高至91.54%（突变型）；Ramachandran图分析显示最有利区域残基从79.1%增至82.3%，不允许构象从3.4%降至2.0%；ProSA Z-score从?6.09改善至?5.058，表明突变模型具有更能量有利且准确折叠的构象。
分子动力学模拟：200 ns模拟中，突变型RMSD在约70 ns后达到平衡并保持稳定；RMSF显示突变型整体波动低于野生型；两种肽的氢键数量范围均在400–450之间，平均值分别为397.37和397.31；突变型Rg值从约3.4 nm降至1.8 nm后保持稳定；SASA在90 ns后达到平台期，野生型和突变型平均值分别为105.46和117.16 nm2，均表明稳定构象。
讨论与结论
研究人员指出，LL-37和HNP-1天然由中性粒细胞共释放，通过“双重协同性”现象互补增强抗菌活性并保护宿主组织。本研究将两者保守结构域整合为单一构建体，通过刚性EAAAK连接肽维持结构独立性，实现同时靶向病毒包膜和细菌膜的能力。单链设计简化了制剂复杂性，降低了生产和递送成本，同时增强结构稳定性和抗蛋白酶降解能力。突变优化改善了结构紧凑性、溶解性、两亲性和预测抗菌效力，同时保持非毒性。分子动力学分析证实突变型肽在溶液中具有优越的稳定性、理化性质和折叠行为。这些发现凸显了工程化双结构域肽作为针对呼吸道感染的广谱治疗剂的潜力，并为吸入式或纳米颗粒递送系统提供了可行平台。研究人员强调，仍需实验性抗菌测定以验证其生物活性，但计算研究结果为后续转化研究奠定了坚实基础。
