引言
癌症仍然是全球-leading的死因，并造成巨大的全球健康负担[1], [2]。早期检测可以显著改善癌症治疗结果和生存率[3]。然而，许多癌症在早期阶段仍无明显症状，往往在病情进展后才被诊断[4], [5]。这一临床现实凸显了迫切需要高灵敏度、无创地检测早期癌症和癌前病变中的生物标志物，以便及时干预[6], [7], [8]。核酸已成为极具前景的无创生物标志物，在癌症早期检测、诊断和疾病监测方面具有相当大的潜力，为提高患者生存率作出了巨大贡献[9], [10]。在核酸生物标志物中，非编码RNA（ncRNAs）尤其受到关注。ncRNA家族包括长非编码RNA（lncRNAs）、核糖体RNA（rRNAs）、转运RNA（tRNAs）、小RNA（如微小RNA（miRNAs）、piwi相互作用RNA（piRNAs）、小核RNA（snRNAs）和小核仁RNA（snoRNAs））以及环状RNA（circRNAs）。这些RNA分子参与多种生物过程，如RNA修饰、转录调控、前体mRNA剪接、蛋白质翻译和翻译后修饰[11], [12], [13], [14], [15], [16]。ncRNA表达失调与一系列疾病密切相关，包括癌症[17], [18], [19], [20], [21]、心血管疾病[22]、神经退行性疾病[23]和自身免疫性疾病[24], [25]，凸显了其广泛的诊断和预后潜力。然而，ncRNA的准确检测面临重大技术挑战。许多临床上相关的ncRNA在含量极低，特别是在早期肿瘤和循环生物流体中[26], [27]。RNA降解、大量背景RNA的共分离以及蛋白质、脂质、盐和其他内源性成分的干扰进一步使样品制备复杂化[28], [29]。此外，ncRNA表现出显著的异质性，涵盖短型和长型异构体，具有多种化学修饰，并形成动态的二级结构，所有这些都使得其特异性和灵敏度的表征尤为困难[27]。这些生物学和分析障碍阻碍了基于ncRNA的生物标志物的临床转化，需要创新的检测策略。传统分析方法为ncRNA分析提供了有价值的工具，但它们存在固有的局限性，阻碍了其在快速、灵敏且低成本检测中的应用。逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）因其高灵敏度和成熟的定量工作流程而被广泛使用。然而，其性能高度依赖于精心的引物设计、逆转录效率以及多步扩增程序[30], [31], [32]。基于微阵列的平台能够并行分析多种RNA靶标，但其应用通常受到动态范围狭窄和易受交叉杂交伪影的影响[33], [34]。高通量测序可提供全面的转录组信息并促进新型ncRNA物种的发现，但通常需要昂贵的仪器和耗时的文库制备[35], [36]。尽管它们在集中式实验室环境中功能强大，但这些传统方法并不适合实际应用，而实际应用要求速度、可负担性和操作简便性至关重要。
作为一种下一代诊断平台，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及CRISPR相关（Cas）蛋白系统已成为核酸分析的强有力工具[37], [38], [39], [40], [41]。在多种CRISPR系统中，II类效应物，特别是Cas9、Cas12a、Cas13a以及Cas14/Cas12f家族（表1），在诊断应用中日益受到关注，因为单个效应蛋白可以通过向导RNA轻松编程，大大简化了生物传感器的设计（图1）。Cas9是最早用于生物传感的CRISPR效应物，已被应用于依赖序列特异性靶标识别、切割辅助分析、突变区分和结合介导传感的策略[42], [43], [44], [45], [46], [47]。然而，尽管Cas9在DNA编辑和核酸检测方面表现出色，但其直接用于ncRNA分析受到固有制约，因为其经典活性需要包含原间隔序列邻近基序（PAM）的DNA底物，限制了其对RNA靶标的直接识别[48], [49]。同样，最近表征的Cas14a/Cas12f效应物尽管具有体积小和不匹配区分能力高的优势，适合微型化检测，但它们主要由单链DNA底物激活，对RNA靶标的响应有限[50], [51]。相比之下，Cas12a和Cas13a在生物传感平台中被更广泛采用，因为它们的靶标激活的反式切割活性能够通过串联切割报告分子实现直接的信号放大，使其特别适用于超灵敏RNA检测[37], [52], [53], [54]。因此，本综述主要关注整合纳米材料的基于Cas12a和Cas13a的荧光生物传感器用于ncRNA检测。
基于CRISPR的诊断技术越来越多地与荧光、电化学、比色和微流控读出方法结合，以增强分析性能和转化潜力[55]。在这些模式中，荧光生物传感已成为一种广泛使用的策略，因其高灵敏度、易于量化、多重检测能力以及适应便携式设备的能力[56], [57], [58], [59]。然而，基于CRISPR的荧光传感器的分析性能经常受到信号强度不足、背景干扰和靶标识别转化为可测量信号效率不高的限制。
为解决这些局限性，纳米技术已成为增强生物传感性能的强有力互补策略。凭借独特的物理化学性质（例如可调节的光学行为、大表面积、催化活性、磁响应性和多样的表面功能化[60], [61], [62]），功能性纳米材料可以被合理整合到检测系统中，以显著提高分析性能[63], [64]。例如，荧光纳米材料可以增强亮度和光稳定性，从而实现高灵敏度的检测。猝灭纳米平台可以有效抑制背景噪声以提高信噪比。磁性纳米材料便于靶标的快速分离和富集，而纳米级载体可以在空间上组织生物分子组分并加速反应动力学。这些多功能特性使纳米技术对于利用基于CRISPR的荧光生物传感器检测痕量核酸生物标志物尤为具有吸引力[65], [66]。与以往主要关注CRISPR/Cas传感机制和分析策略的综述[67], [68]不同，本综述从纳米材料功能及其对分析性能贡献的角度总结了整合纳米材料的CRISPR/Cas荧光生物传感器。纳米材料根据其作为荧光标记物、猝灭剂、分离器和载体的主要角色进行分类，并从灵敏度、背景抑制、反应动力学、基质耐受性和操作复杂度方面进行比较。这些比较为根据靶标ncRNA的性质、样品基质和分析需求选择纳米材料提供了框架。在本文中，我们首先概述了四大类ncRNA（即miRNA、lncRNA、circRNA和piRNA）及其作为疾病生物标志物的重要性。然后讨论了纳米材料整合的CRISPR/Cas荧光生物传感平台的核心设计原理、纳米材料的功能贡献及其代表性应用，接着对纳米材料类别进行了比较分析以指导合理选择。此外，我们讨论了这一快速发展的领域中当前面临的挑战和未来方向。
