《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Point-of-Care Nucleic Acid Testing: Device Miniaturization and Workflow Integration towards "Sample-in-Result-out"
编辑推荐：
•工作流程框架：为集成化、微型化的“样品进结果出”POC-NAT 系统建立以工作流程为导向的路线图。•免提取采样：阐明免提取预处理策略，实现与下游兼容的核酸分析。•等温微型化：强调等温扩增和 CRISPR 整合以实现紧凑且鲁棒的分子诊断。•传感器耦合：提出连接生化反应与微型传
- •
工作流程框架：为集成化、微型化的“样品进结果出”POC-NAT 系统建立以工作流程为导向的路线图。
- •
免提取采样：阐明免提取预处理策略，实现与下游兼容的核酸分析。
- •
等温微型化：强调等温扩增和 CRISPR 整合以实现紧凑且鲁棒的分子诊断。
- •
传感器耦合：提出连接生化反应与微型传感器的通用信号耦合原理。
- •
数字化与人工智能：讨论 AI 赋能的分析和数字化分析，用于多维度的即时诊断。
引言
核酸检测（NAT）是现代分子诊断的基石，广泛应用于多种场景，包括临床筛查或预后[1]、食品安全监控[2]、法医调查[3]。然而，传统 NAT 被局限于集中式实验室，其中涵盖样品制备、核酸提取、扩增、信号读取和数据解读的多步工作流程由受训人员和笨重的仪器执行。相比之下，即时检测（POCT）通过在近患者端和资源有限的环境中进行分析，旨在实现该过程的去中心化，从而减少专业依赖和周转时间[4]。因此，即时核酸检测（POC-NAT）代表了从实验室受限分析向集成化、便携且用户友好的诊断系统的范式转变。
尽管具有概念吸引力，POC-NAT 仍受到几个系统级挑战的制约。首先， assays 工作流程往往是分离的，需要顺序操作，难以整合到单一设备中。许多报道的 POC-NAT 仍然依赖设备外的核酸（NA）提取作为前提条件[5]。其次，工作流程阶段之间的化学和操作不兼容性，特别是在样品处理、核酸扩增和信号产生之间，损害了在简化条件下的鲁棒性和可靠性[6]，[7]。第三，向手持或可穿戴格式的设备进一步微型化受到内在需求的限制，包括热控制、流体处理和外围检测系统[8]。这些限制也影响了更高通量和后续信号解读的能力。为了完全释放 POC-NAT 的潜力，解决这些挑战至关重要。虽然近期文献广泛记录了诊断组件的离散进展（例如，NA 反应、CRISPR/Cas、微流控），但这些以 assay 为中心的视角往往忽视了构建此类设备时的模块间摩擦。可以提供一个更清晰的愿景，用于检查需要进一步研究的领域。
在本综述中，我们旨在通过总结发展趋势并详细阐述工作流程每个步骤的可能解决方案，概述构建微型化、集成化 POC-NAT 设备的技术指南。如图 1 所示，典型的 POC-NAT 工作流程包括四个紧密耦合的阶段：样品预处理、核酸扩增、信号产生与转换以及后分析。与其将每个步骤视为孤立的运营，有效的 POC-NAT 构建需要系统级的考虑上游选择如何约束下游策略。优化的整体设计应能实现“样品进结果出”的方式，即用户只需输入原始样品，即可通过自动化过程获得诊断结果，而无需专业技能或实验室仪器。这种能力允许患者进行自我检测，并最大限度地减少他们对住院期间专业医疗服务的依赖。
在此，我们主张设计 POC-NAT 系统涉及确定这些模块如何被选择、简化、合并或重排，以平衡分析性能和操作复杂性。在上游，传统采样需要多步离板操作，而最小处理策略允许在设备上进行原位采样。早期 POC-NAT 主要依赖将既定的实验室方案（特别是聚合酶链反应（PCR））简化为便携式格式。虽然有效，但此类方法通常保留了严格的热循环、机械精度和光学对准要求。作为回应，等温扩增的连续创新重新设计了设备架构。此外，信号耦合正从离散、模块化的检测向更统一和集成的方案演进，该方案直接将多个化学反应与传感器接口。在下游， assays 的数字化增加了后分析范围，从简单的阈值决策扩展到更高维度的数据解读，为计算和 AI 辅助分析创造了机会。这些进展共同将 POC-NAT 重新定位为不仅是缩小规模的实验室 assay，而且是化学和系统协同设计的平台。以下章节详细介绍了工作流程的每个阶段，突出了化学、材料、设备工程和信息技术方面的协调创新如何共同推动 POC-NAT 走向真正的“样品进结果出”操作。
章节摘录
采样：核酸提取
典型的 NAT 始于从复杂样品中分离 NA。考虑到临床标本的多样性，通常需要不同的预处理程序[9]。此外，目标遗传物质（无论是病原体衍生还是内源性的）往往以痕量水平存在，需要灵敏的分析方法[10]，[11]。迄今为止，已开发了各种样品预处理策略，其中许多采用自传统分子生物学方案。
历史上，NA 提取
扩增：从热循环到等温化学
在识别复杂样品中的目标 NA 后，通常采用扩增来增加目标拷贝数至可检测水平。PCR 是最常见的技术，仍然是临床和检测环境中分子诊断的金标准。热循环程序反复驱动 DNA 进行变性、退火和延伸，导致拷贝数指数级扩增（图 3A）。
除了配备精确的...
CRISPR 连接扩增与信号
NA 扩增技术中一个不可忽视的趋势是 CRISPR/Cas 系统日益增长的整合应用[88]，[89]，[90]。CRISPR/Cas 系统最初进化为细菌和古菌中的适应性免疫机制，通过序列特异性识别和切割外来 NA 来防御入侵的噬菌体、质粒和转座子[91]。在此过程中，目标衍生的 CRISPR RNA（crRNA）与 Cas 蛋白组装形成核糖核蛋白（RNP）复合物，结合互补序列...
信号：通过耦合信号可视化核酸
在目标 NA 分离和扩增之后，除非转换为可测量信号，否则在分析上仍是不可见的。因此，信号耦合构成 NAT 中的关键步骤，使分子信息可检测、定量，甚至对物理传感器选择具有决定性。在金标准定量 PCR（qPCR）中，两种化学方法在实时可视化 PCR 产物中占主导地位：嵌入染料（例如 SYBR Green）和序列特异性水解探针（例如...
特征分析：POCT 系统中的后分析与信息工程
对于 POCT 系统，不可避免地需要外围设备来收集和处理生化工作流程中产生的信号，理想情况下是以低成本和用户友好的方式。台式仪器和 POCT 设备之间的一个根本区别在于，在便携和资源有限的环境中，复杂的机械结构和笨重、高分辨率的转换系统是不切实际的[157]。
如图 5 所示，信号模态的选择强烈影响设备...
未来展望
综上所述，近年来整个 POC-NAT 工作流程的进展，从免提取采样和简化扩增到集成信号耦合和数据驱动的特征分析，已逐步减少了操作复杂性，同时扩展了分析能力。这些发展表明从孤立地优化单个步骤转向系统级协同设计，以及从仅基于分析性能的评估转向实地研究能力。显然，POC-NAT 是...
CRediT 作者贡献声明
Zhaofan Luo：监督，获取资金。Huiwen Wang：验证，概念化。Changqing YI：写作 – 审阅与编辑，获取资金，概念化。Mengsu Yang：写作 – 审阅与编辑，验证，获取资金。Kang Wang：写作 – 原稿，调查。Zipei Yu：写作 – 原稿，可视化，调查，概念化。Tingting Feng：写作 – 原稿，验证
竞争利益声明
? 作者声明他们没有已知的相互冲突的经济利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文报告的工作。
致谢
感谢国家重点研发计划（编号：2022YFE0201800）、香港创新科技基金（MHP05221）、中央高校基本科研业务费专项资金（中山大学，24xkjc025）、深圳科技创新计划（KCXFZ20230731094003006）、珠海产业 - 学术 - 研究合作项目（23200004002700）、广东省钟南山医学基金会（ZNSXS-20250060）以及深圳临床...的资金支持。
余子佩|王康|冯婷婷|王慧文|罗钊凡|杨孟苏|易长青
