CXCL9通过激活CXCR3/JAK1/STAT3信号通路驱动肺腺癌进展及免疫治疗应答

《Translational Oncology》：CXCL9 Drives Lung Adenocarcinoma Progression and Immunotherapy Response via Activation of the CXCR3/JAK1/STAT3 Signaling Pathway

　　

摘要 趋化因子CXCL9在塑造肿瘤免疫微环境中发挥关键作用，但其在肺腺癌（LUAD）中的生物学功能及临床意义尚存争议。本研究旨在阐明CXCL9在LUAD中的临床意义与生物学功能，并调和其免疫激活与促肿瘤作用。研究人员利用癌症基因组图谱（TCGA）泛癌数据、免疫治疗队列及单细胞RNA测序数据进行生物信息学分析，随后在HCC827和HCC44细胞系中进行功能获得与缺失实验，并利用异种移植瘤模型验证体内效应。结果显示，CXCL9在多种肿瘤中表达上调，且高表达与LUAD患者较差的总生存期显著相关。在PD-L1免疫治疗应答者中，CXCL9表达水平显著升高，且与多种免疫激活通路活性呈正相关。单细胞分析表明CXCL9主要由单核细胞/巨噬细胞表达，在恶性细胞中亦有少量表达。体外功能实验证实，CXCL9敲低可抑制LUAD细胞增殖、迁移和侵袭并促进凋亡，而过表达则产生相反效应；体内实验同样证实CXCL9过表达促进肿瘤生长。机制研究表明，CXCL9通过其受体CXCR3激活JAK1/STAT3信号通路，上调BIRC5、CCL2、SNAI1和SOX2等下游效应分子表达。JAK1/2抑制剂Ruxolitinib可逆转CXCL9驱动的恶性表型及体内肿瘤生长。综上，本研究揭示了CXCL9/CXCR3/JAK1/STAT3信号轴在LUAD进展中的关键作用，为LUAD的预后评估和靶向治疗提供了新的潜在生物标志物与治疗靶点。

一、研究背景与科学问题

肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是全球最常见的肺癌病理亚型，2020年全球肺癌新发病例约221万例，其中腺癌在女性和男性中分别占57%和39%，中国肺癌发病与死亡人数分别占全球负担的37.0%和39.8%。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的出现显著改变了晚期LUAD的治疗格局，但仍有相当比例患者无法从中获益，因此寻找可靠的疗效预测生物标志物并阐明免疫治疗应答的分子机制成为当前研究的重点。

CXCL9是一种干扰素γ（IFN-γ）诱导的趋化因子，通过招募自然杀伤（NK）细胞和T淋巴细胞参与塑造肿瘤免疫微环境。既往研究表明CXCL9在多种肿瘤中与免疫细胞浸润增加和更好的治疗预后相关，但同时也有证据提示高CXCL9表达可能与不良预后并存，提示其功能具有明显的肿瘤类型和微环境依赖性。这种看似矛盾的现象提示CXCL9可能通过免疫介导机制和肿瘤内在机制分别发挥不同效应，但其在LUAD中的具体生物学功能及分子机制尚未被系统阐明。

针对上述问题，研究人员开展了本研究，旨在系统阐明CXCL9在LUAD中的临床意义、生物学功能及其潜在分子机制，并探索靶向该通路的治疗策略。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过整合TCGA泛癌数据、两个抗PD-L1免疫治疗队列（GSE126044、GSE135222）及单细胞RNA测序数据（EMTAB6149），结合体外细胞功能实验和体内异种移植瘤模型，系统揭示了CXCL9在LUAD中的双重角色。研究发现CXCL9在免疫治疗应答者中高表达，与免疫激活通路显著相关，同时高表达CXCL9又预示LUAD患者不良预后。功能实验证实CXCL9通过其受体CXCR3激活JAK1/STAT3信号通路，促进LUAD细胞增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡，而JAK1/2抑制剂Ruxolitinib可有效逆转上述促癌效应。该研究确立了CXCL9/CXCR3/JAK1/STAT3信号轴在LUAD进展中的关键作用，为LUAD的预后分层和靶向治疗提供了新的理论依据。

三、主要技术方法

本研究综合运用了多种生物信息学与实验技术手段。生物信息学分析方面，利用TCGA数据库（33种实体瘤）进行差异表达和预后分析，采用limma包筛选差异基因，利用survminer包进行生存分析；对免疫治疗队列GSE126044（5例应答者、11例非应答者）和GSE135222（8例应答者、19例非应答者）进行差异基因筛选、功能富集分析（GO/KEGG）及蛋白互作网络分析；利用单细胞数据集EMTAB6149（5例肺癌患者）进行单细胞WGCNA共表达网络分析、细胞间通讯推断及CXCL9表达特征分析；通过ssGSEA评估免疫通路活性与CXCL9的相关性，并分析CXCL9与肿瘤突变负荷（TMB）的相关性。实验方面，采用慢病毒介导的shRNA敲低和质粒过表达技术构建CXCL9基因修饰的LUAD细胞系（HCC827、HCC44），通过划痕实验、Transwell侵袭实验和Annexin V/PI流式凋亡检测评估细胞功能，利用Western blot和qRT-PCR检测蛋白和mRNA表达，通过ELISA检测CXCL9分泌水平，并在BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型中验证体内效应。此外，收集了28例免疫治疗患者（9例应答者、9例非应答者）的血清和肺泡灌洗液样本进行CXCL9水平检测。

四、研究结果

1. CXCL9在多种肿瘤中表达上调且预示LUAD不良预后

通过对TCGA 33种肿瘤的泛癌分析发现，CXCL9在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、结肠腺癌（COAD）、LUAD、胃癌（STAD）等多种肿瘤中较正常组织显著上调。单因素Cox回归分析显示，CXCL9高表达在包括LUAD在内的多种肿瘤中与总生存期显著相关。Kaplan-Meier生存分析进一步证实，在LUAD中CXCL9高表达与显著更差的总生存期相关，而在BRCA、COAD、KIRC中未见显著预后关联。

2. CXCL9在免疫治疗应答者中上调并富集于免疫激活通路

对GSE126044和GSE135222两个PD-L1治疗队列的分析发现，应答组与非应答组间存在85个共同差异表达基因，功能富集分析显示这些基因主要富集于Toll样受体（TLR）信号通路、自然杀伤细胞增殖和趋化因子信号通路。蛋白互作网络分析显示CXCL9具有最高的互作度。在两个数据集中，CXCL9在应答组中均显著高表达。临床样本检测进一步证实，应答组血清和肺泡灌洗液（BALF）中CXCL9蛋白水平均显著升高，且血清与BALF水平呈显著正相关。相关性分析显示，CXCL9表达与趋化因子信号、细胞因子-细胞因子受体互作、IFN-γ应答、PD-1/PD-L1检查点、TLR信号、JAK-STAT信号及IL6-JAK-STAT3信号等七条免疫相关通路活性在TCGA泛癌、TCGA-LUAD及两个免疫治疗队列中均呈显著正相关。

3. CXCL9在非小细胞肺癌中主要由单核细胞/巨噬细胞表达并与免疫微环境重塑相关

TCGA-LUAD高低CXCL9表达组间差异表达分析鉴定出1891个差异基因，功能富集显示主要涉及细胞因子受体互作、Th17细胞分化和趋化因子信号通路。单细胞测序分析显示CXCL9主要表达于单核细胞和巨噬细胞，在恶性细胞中也有少量表达。对CXCL9阳性与阴性恶性细胞差异分析鉴定出875个差异基因，富集分析显示与免疫应答相关。WGCNA分析鉴定出14个基因模块，其中CXCL9所在的棕色模块富集IFIT和CXCL家族基因。细胞通讯分析显示成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞与恶性细胞间存在显著的CXCL9相关信号交互。此外，CXCL9表达在泛癌整体及包括LUAD在内的多种肿瘤中与肿瘤突变负荷（TMB）呈显著正相关。

4. CXCL9在体外和体内促进LUAD细胞增殖、迁移和侵袭

在HCC827细胞中敲低CXCL9显著抑制细胞迁移（划痕实验）和侵袭（Transwell实验），并增加细胞凋亡率；在HCC44细胞中过表达CXCL9则显著增强迁移和侵袭能力并降低凋亡率。体内异种移植瘤模型中，CXCL9过表达组肿瘤体积和重量显著大于对照组。Western blot显示CXCL9过表达肿瘤组织中BIRC5和p-STAT3蛋白水平升高，而总STAT3不变。免疫组化（IHC）染色显示CXCL9过表达肿瘤中Ki67、p-STAT3和CXCL9阳性率均显著增加。

5. CXCL9通过CXCR3激活JAK1/STAT3信号通路

GSEA分析显示CXCL9过表达细胞显著富集于"IL6-JAK-STAT3信号"通路。Western blot证实，CXCL9敲低降低p-JAK1和p-STAT3水平，过表达则显著升高p-JAK1和p-STAT3水平，而总JAK1和STAT3蛋白不变。重组CXCL9刺激HCC44细胞后p-STAT3呈时间依赖性升高，在30-60分钟达到峰值。JAK1/2抑制剂Ruxolitinib可完全消除CXCL9过表达诱导的p-STAT3上调，并逆转CXCL9过表达增强的迁移能力和抗凋亡效应。体内实验中，Ruxolitinib显著抑制CXCL9过表达肿瘤的生长，降低肿瘤体积、重量及Ki67和p-STAT3表达。

6. CXCL9通过CXCR3受体激活STAT3信号

CXCR3拮抗剂AMG487处理可显著抑制CXCL9过表达细胞中升高的p-STAT3水平。qRT-PCR和Western blot证实LUAD细胞系中CXCR3在mRNA和蛋白水平均有表达。siRNA敲低CXCR3后，CXCL9过表达诱导的p-STAT3上调被显著消除。ELISA检测证实CXCL9过表达细胞可分泌大量CXCL9蛋白，条件培养基（CM）处理可显著提高受体细胞STAT3磷酸化水平，证实CXCL9可通过自分泌/旁分泌方式激活STAT3信号。

五、讨论与结论

讨论部分总结： 研究人员在讨论中指出，CXCL9在不同肿瘤类型中表现出矛盾的功能，既有促进抗肿瘤免疫的证据，也有促进肿瘤进展的报道，其生物学结果高度依赖于肿瘤微环境的炎症、突变和代谢背景。本研究通过单细胞分析明确了单核细胞/巨噬细胞是CXCL9的主要来源，但肿瘤内在的CXCL9信号可通过CXCR3/JAK1/STAT3轴以自分泌或旁分泌方式促进恶性表型。研究还发现TLR信号通路与PD-L1免疫治疗应答密切相关，TLR激动剂可能增强PD-1/PD-L1阻断疗法的效果。JAK/STAT通路是公认的肿瘤进展调节通路，Ruxolitinib作为选择性JAK1/2抑制剂可有效逆转CXCL9驱动的促癌效应。此外，CXCL9可能还通过调节免疫细胞招募影响免疫治疗疗效，提示靶向该轴可能同时影响肿瘤细胞信号和免疫调节。研究也指出了局限性，包括临床验证队列样本量较小、裸鼠异种移植模型缺乏完整T细胞免疫、以及肿瘤来源与免疫细胞来源CXCL9的相对贡献尚需进一步阐明。

研究结论： 本研究鉴定CXCL9为LUAD中与PD-L1免疫治疗应答和肿瘤进展相关的关键调节因子。整合生物信息学分析和实验验证表明，CXCL9在免疫治疗应答者中高表达，并可促进LUAD细胞增殖、迁移、侵袭和抗凋亡能力。机制上，LUAD细胞分泌的CXCL9结合CXCR3并激活JAK1/STAT3信号通路，而Ruxolitinib抑制可在体内外有效逆转其致癌效应。综上，本研究为免疫治疗应答的分子机制提供了新见解，并提示CXCL9/CXCR3/JAK1/STAT3信号轴可作为LUAD的潜在预后生物标志物和治疗靶点。