基于孟德尔随机化的RAF1与MAPK8基因表达对胰腺癌风险的遗传评估及循环免疫特征的探索性中介分析

《Translational Oncology》：Genetic evaluation of encorafenib-associated kinases RAF1 and MAPK8 in pancreatic cancer: Exploratory mediation by circulating immune traits

　　

背景：胰腺癌（pancreatic cancer, PC）是全球最致命的恶性肿瘤之一，五年生存率低于10%。其隐匿性发病和快速进展常导致晚期诊断，严重限制了手术和化疗等常规疗法的疗效。调节肿瘤微环境中的免疫抑制状态已成为一个有前景的研究方向。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路是PC发病机制的核心，不仅驱动肿瘤细胞增殖和存活，还深刻影响肿瘤微环境的免疫格局。康奈非尼（encorafenib）是一种选择性RAF激酶抑制剂，体外证据表明其可抑制由RAF1编码的CRAF并结合由MAPK8编码的JNK1，但其在PC中的作用机制尚不明确，尤其是免疫调节是否参与其中。目的：本研究旨在利用孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）框架，系统探究遗传代理的RAF1和MAPK8表达与PC风险之间的关联，并探索循环免疫表型（特别是调节性T细胞相关特征）在此关联中的潜在中介作用。方法：采用基于表达数量性状位点（expression quantitative trait loci, eQTL）的两样本两步MR设计。遗传工具变量（instrumental variables, IVs）选自欧洲人群的eQTL数据，暴露为RAF1和MAPK8的遗传代理表达，结局为PC（来自GWAS数据集，共476,245名参与者，含1,196例病例）。第一步评估基因表达与PC风险的因果关系；第二步筛选731种循环免疫表型作为候选中介，并通过两步MR计算中介比例。敏感性分析包括MR-Egger回归、加权中位数法、MR-PRESSO及留一法分析。此外，进行全表型组关联研究（PheWAS）评估遗传工具的广泛多效性。结果：逆方差加权（inverse-variance weighted, IVW）分析显示，MAPK8表达（OR=0.829, 95%CI: 0.740-0.929, P=0.001）和RAF1表达（OR=0.748, 95%CI: 0.633-0.882, P=0.001）均与PC风险降低显著相关，且未检测到显著的异质性或水平多效性。在候选中介中，活化和静息CD4+调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）相关表型显示出最大的正向估计中介比例：对于MAPK8为16.202%（95%CI: 12.945%-19.460%），对于RAF1为10.607%（95%CI: 6.950%-14.263%）。PheWAS分析未发现RAF1或MAPK8遗传工具在预设阈值下存在广泛的遗传多效性信号。结论：本研究提供了遗传学证据，支持RAF1和MAPK8表达与PC风险降低的关联。两步MR分析进一步提示，循环中活化和静息CD4+ Treg相关表型可能部分介导了这些关联，表明系统性免疫调节可能在其中发挥一定作用。这些发现支持进一步研究RAF1和MAPK8相关通路在PC中的生物学意义及其在康奈非尼治疗背景下的药理学含义。

研究背景与科学问题

胰腺癌（pancreatic cancer, PC）是全球致死率最高的恶性肿瘤之一，五年生存率长期低于10%，且预计至2060年相关死亡人数将翻倍。其隐匿起病和快速进展的特点导致多数患者确诊时已处于晚期，传统的手术和化疗效果极为有限。近年来，调节肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的免疫抑制状态成为极具前景的治疗策略。PC的TME以深度免疫抑制为特征，其中调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）等免疫抑制细胞的浸润促进了免疫逃逸和肿瘤进展。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路是PC发病机制的基石，尤其在携带KRAS突变的肿瘤中持续激活，不仅直接驱动肿瘤细胞增殖和存活，还深刻重塑TME的免疫景观。值得注意的是，MAPK通路抑制剂（如RAF激酶抑制剂）已在BRAF突变黑色素瘤中取得突破，既能直接抑制肿瘤生长，又能通过与免疫治疗的协同作用增强疗效。然而，这一策略能否通过免疫调节效应应用于PC仍是一个尚未探索的关键问题。康奈非尼（encorafenib）作为一种选择性RAF激酶抑制剂，体外证据表明其可抑制由RAF1编码的CRAF并结合由MAPK8编码的JNK1，但其在PC中的具体作用机制，特别是免疫调节是否参与其中，尚不清楚。因此，阐明RAF1和MAPK8相关通路的生物学相关性，对于推动其在PC中的进一步实验评估具有重要意义。

研究设计与技术方法

为解答上述问题，研究人员采用孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）这一遗传流行病学方法，利用遗传变异作为工具变量（instrumental variables, IVs）评估潜在因果关系，以减少混杂和反向因果的影响。研究采用两样本两步MR框架。首先，从IEU OpenGWAS项目获取汇总级遗传数据，包括九种候选基因（CCND1、RAF1、STK36、MAPK9、MAPK8、LIMK2、MAP2K4、LIMK1、BRAF）的表达数量性状位点（expression quantitative trait loci, eQTL）数据，以及731种循环免疫表型的GWAS数据、PC的GWAS数据（来自欧洲人群，共476,245名参与者，含1,196例病例）和三种对比癌症结局数据。IVs的选择严格限定在目标基因顺式作用区域（100 kb范围内），并通过连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）修剪（r2<0.3）、剔除回文SNP、使用MR-PRESSO去除离群值、以及利用PhenoScanner排除与混杂因素或结局相关的SNP。统计分析采用多种回归模型，以逆方差加权（inverse-variance weighting, IVW）法为主要分析方法，辅以MR-Egger回归、加权中位数估计法（weighted median estimator, WME）、简单模式和加权模式进行互补分析。中介效应分析采用两步MR方法，通过系数乘积法计算中介比例。此外，通过AstraZeneca PheWAS门户进行全表型组关联研究（PheWAS），评估RAF1和MAPK8遗传工具在17,361种二元和1,419种定量表型中的广泛遗传关联。

研究结果

1. 1.
   遗传代理的RAF1和MAPK8表达与胰腺癌风险的关联：IVW分析显示，MAPK8表达（OR=0.829, 95%CI: 0.740-0.929, P=0.001）和RAF1表达（OR=0.748, 95%CI: 0.633-0.882, P=0.001）均与PC风险降低显著相关。所有敏感性分析和多效性检验均未发现显著异质性或多效性证据。在其他候选基因中，仅MAP2K4表达显示出名义上的IVW关联（OR=1.533, 95%CI: 1.099-2.137, P=0.012），被视为假设生成性发现。
2. 2.
   RAF1和MAPK8表达与循环免疫表型的探索性关联：在名义显著性阈值（P<0.05）下，探索性IVW分析识别出MAPK8表达与196种循环免疫表型之间存在候选关联，其中76种呈负相关，120种呈正相关。同样，RAF1表达与207种免疫表型存在名义关联，包括140种负相关和67种正相关。
3. 3.
   循环免疫表型与胰腺癌风险的探索性关联：在名义显著性阈值下，IVW分析确定了35种与PC风险相关的循环免疫表型，其中18种呈负相关，17种呈正相关。例如，CD86+浆细胞样树突状细胞绝对计数（OR=0.768, 95%CI: 0.634-0.931, P=0.007）与风险降低相关，而终末分化CD4+ T细胞百分比（OR=1.398, 95%CI: 1.106-1.766, P=0.005）与风险增加相关。
4. 4.
   探索性两步MR分析：候选循环免疫中介：共有17种不同的循环免疫表型被纳入两步MR分析。其中，活化和静息CD4+ Treg相关表型在两个基因特异性分析中均显示出最大的正向估计中介比例。对于MAPK8，估计中介比例为16.202%（95%CI: 12.945%-19.460%），效应估计值为β?=0.187（P<0.05），β?=-0.162（P=0.049），β?=-0.188（P=0.001）。对于RAF1，对应中介比例为10.607%（95%CI: 6.950%-14.263%），效应估计值为β?=0.190（P=0.001），β?=-0.162（P=0.049），β?=-0.291（P=0.001）。
5. 5.
   遗传代理的MAPK8和RAF1表达与其他癌症结局的关联：作为补充比较分析，IVW分析显示MAPK8表达是甲状腺恶性肿瘤（OR=0.728, 95%CI: 0.634-0.836, P<0.001）和非霍奇金淋巴瘤（OR=0.825, 95%CI: 0.686-0.993, P=0.042）的保护因素。RAF1表达与非小细胞肺腺癌风险降低相关（OR=0.641, 95%CI: 0.437-0.941, P=0.023）。
6. 6.
   PheWAS评估广泛遗传关联：在UK Biobank的PheWAS分析中，RAF1和MAPK8遗传工具均未达到全基因组显著性阈值（P>5×10??）。全局多效性检验也未发现显著差异（RAF1的P=0.17，MAPK8的P=0.06）。

讨论与结论总结

讨论部分指出，MAPK信号通路在PC发生发展中发挥核心作用，RAF1和MAPK8的表达改变可能通过多种相互关联的生物过程影响PC风险。探索性中介分析提示，循环Treg相关变异可能是连接RAF1/MAPK8生物学与PC风险的若干通路之一，但中介比例相对较小，表明大部分效应可能涉及其他机制，如额外的免疫细胞群体、肿瘤内在MAPK信号、基质重塑、血管生成、代谢调控和炎症反应。研究强调，循环免疫表型与肿瘤浸润免疫群体代表相关但不同的免疫区室，因此Treg相关发现应解释为与PC风险相关的系统性免疫变异，而非直接反映肿瘤组织内Treg的功能状态。关于药物相关性，虽然RAF1和MAPK8与康奈非尼的体外药理谱相关，但MR分析反映的是终生遗传代理的基因表达差异，与药理学效应不同。PheWAS分析未发现广泛的多效性信号，增强了遗传工具的特异性。

研究结论部分原文翻译如下：总之，本研究提供了遗传学证据，支持RAF1和MAPK8表达与PC风险的关联。两步MR分析进一步提示，循环中活化和静息CD4+ Treg相关表型可能贡献了这些关联的一小部分，表明系统性免疫调节可能存在一定的参与。进一步的組織特异性、功能学和药理学研究可能有助于阐明RAF1和MAPK8相关通路在PC中的生物学相关性及其在康奈非尼背景下的药理学含义。