一种可重复、低成本的离体超声刺激（LIVUS）方法的开发与表征

《Ultrasonics》：Development and characterization of a reproducible, low-cost in vitro ultrasound stimulation (LIVUS) method

　　

摘要

超声波已在诊断和治疗领域使用了数十年。低强度脉冲超声波（LIPUS）近年来作为一种有前景的低能量治疗手段崭露头角，其作用依赖于细胞的机械转导而非热效应。尽管LIPUS在骨愈合和细胞调控等多个临床应用中日益广泛，但其应用的转化仍需要可靠的体外系统，以实现超声波参数和生物学反应的系统筛选。然而，现有的体外刺激平台往往缺乏对声学参数的充分表征，或者依赖复杂的自制设备，难以复现。在此，我们提出了一种低成本体外超声波刺激（LIVUS）系统，该系统基于标准细胞培养耗材，包括传统培养板和培养插入件。LIVUS系统提供了声学透明路径以刺激培养的人脐动脉平滑肌细胞（HUASMCs），并有效衰减了不必要的声学反射。利用LIVUS系统，我们证明LIPUS可诱导HUASMCs的机械转导表型调控。我们的方法为研究LIPUS对贴壁细胞表型的影响提供了一种实用且可重复的工具。

引言

超声波在临床诊断和治疗应用中已使用了数十年。诊断性超声波常规用于解剖学评估，包括胎儿发育、心脏结构、腹部及肌肉骨骼问题等。利用多普勒模式还可进行功能评估，有助于可视化和量化血管及心脏的血流状况[1]。在治疗方面，超声波的应用范围从用于肌肉骨骼康复的组织加热，到肿瘤热疗和体外碎石术[2]。

超声波治疗手段按波形频率和强度分类。高强度聚焦超声波（HIFUS，例如时空间平均强度>1  kW/cm2，频率0.5–7  MHz）是超声波作为治疗手段的主要应用之一，因为它能够实现组织的局部消融，而不损伤周围区域或使用辐射。另一方面，低强度脉冲超声波（LIPUS，例如用于骨愈合时1.5  MHz下30  mW/cm2）因其显著降低的能量需求即可产生治疗效果而受到关注，常用于骨折治疗[3]。这两种手段的作用机制不同：HIFUS旨在提高组织的局部温度或对目标产生高水平的机械应力，而LIPUS则最小化热效应，依赖受刺激组织细胞群体的机械转导能力来诱导重塑行为[2]、[3]、[4]。这种对热效应的最小化和相对较低的侵入性，使LIPUS作为一种潜在的多种疾病治疗方法受到关注，目前仍在探索中，包括糖尿病[5]、炎症性疾病[6]、勃起功能障碍[7]、神经调控[8]等。然而，新治疗途径的探索以及最终向临床的转化，需要在体外和体内条件下筛选潜在的治疗效果，这便产生了对可重复且有效的体外超声波系统的需求。

多年来，已开发出多种用于筛选LIPUS对细胞影响的体外系统。这些系统从相对简单的装置到高度复杂的自制系统不等[8]、[9]、[10]。然而，现有文献中关于这些系统的报道通常未能准确表征用于刺激的超声波参数，包括超声波束几何形状、压力束衰减以及防止波反射的方法[11]。另一方面，报道了此类机制的系统通常是高度复杂的自制系统，这限制了其他研究团队的复现[11]、[12]。

在此，我们提出了一种低成本的体外超声波刺激（LIVUS）方法，利用日常使用的细胞培养耗材（包括传统细胞培养板和文化插入件）即可实现可重复的LIPUS刺激。该方法展示了LIPUS诱导HUASMCs机械转导表型调控的有效性，并为体外筛选超声波参数和联合疗法提供了可重复的平台。

章节摘要

体外超声波刺激装置的设计标准和概述

超声波刺激装置的设计遵循一套标准，旨在确保其易用性、相对经济性、准确性、可重复性以及潜在的可扩展性。这些标准包括：(i) 从换能器到细胞之间创建一条超声波透明路径，避免沿路径产生反射；(ii) 确保有效的细胞刺激；(iii) 通过尽量减少专有或自制部件的使用来促进装置的可重复性。

LIVUS提供聚焦且可重复的超声波刺激

该超声波系统用于体外刺激培养在聚合物膜上的细胞。我们系统开发的初始步骤包括对超声波换能器产生的负压场进行表征。我们首先测量了在不同峰峰值输入电压下，换能器在聚焦锥中心处产生的负压。换能器对输入电压表现出近似线性的响应，最大值为

讨论

我们开发了一种新型的体外LIPUS刺激培养细胞的系统。我们的系统旨在创建一个可重复但简单、无需高度专用设备即可筛选LIPUS对培养细胞影响的方法。该方法利用基本超声波设备（波形发生器、功率放大器、示波器和换能器）以及日常细胞培养耗材（文化板和细胞培养插入件）。我们的设计为

结论

我们开发了一套用于刺激培养细胞的体外LIPUS系统。我们的系统成功地为培养在插入件上的HUASMCs提供了超声波刺激。受刺激的HUASMCs通过ROCK信号通路表现出表型变化。该系统利用基本超声波设备和经济实惠的细胞培养耗材，提供了一种经济有效的方法来对超声波刺激细胞的效果进行早期筛选。

CRediT作者贡献声明

Sergio A. Pineda-Castillo：写作—审阅与编辑，写作—初稿撰写，方法论，调查研究，形式分析，数据整理，概念构思。Adam B. Tuma：验证，方法论，调查研究，概念构思。Dilshan Rajan：方法论，调查研究。Joellyn S. Speredelozzi：方法论，调查研究。Dzifa Kwaku：方法论，调查研究。Hubert H. Lim：写作—审阅与编辑，监督指导，资金获取，概念构思。Patrick W. Alford：写作—

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Patrick Alford报告获得Solventum Corporation的财务支持。Hubert Lim报告获得Solventum Corporation的财务支持。Patrick Alford报告获得National Institutes of Health的财务支持。Hubert Lim报告获得Minnesota Lions Hearing Foundation的支持。Sergio Pineda Castillo报告获得财务支持

致谢

本研究由与Solventum Corporation的合同（P.W.A, H.H.L）、National Institutes of Health（NIH）R01NS126762（P.W.A.）、Minnesota Lions Hearing Foundation（H.H.L.）、Institute for Translational Neuroscience奖学金基金（H.H.L.）以及American Heart Association 25POST1374562（S.A.P.C.）资助。

Sergio A. Pineda-Castillo|Adam B. Tuma|Dilshan Rajan|Joellyn S. Speredelozzi|Dzifa Kwaku|Hubert H. Lim|Patrick W. Alford

美国明尼苏达大学工程与科学学院生物医学工程系，明尼苏达州明尼阿波利斯