《Clinical Phytoscience》：Enhanced antimicrobial and antibiofilm effects of Baccaurea ramiflora Lour. fruit extract combined with FMSP-nanoparticles against multidrug-resistant bacteria: an in vitro and in silico analysis
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背景：抗菌药物耐药性（AMR）和生物膜相关感染的日益流行对公共卫生构成重大挑战。本研究探讨了木奶果（Baccaurea ramiflora Lour.）果皮（BRP）和种子（BRS）乙醇提取物与荧光磁性亚微米聚合物纳米颗粒（FMSP-NPs）联用，对革兰氏阴性
背景：抗菌药物耐药性（AMR）和生物膜相关感染的日益流行对公共卫生构成重大挑战。本研究探讨了木奶果（Baccaurea ramiflora Lour.）果皮（BRP）和种子（BRS）乙醇提取物与荧光磁性亚微米聚合物纳米颗粒（FMSP-NPs）联用，对革兰氏阴性多重耐药铜绿假单胞菌（MDRPA）和革兰氏阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌和抗生物膜潜力。
方法：通过异相凝聚法合成FMSP-NPs，并利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）进行表征。采用微量肉汤稀释法评估最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）及形态学变化，采用结晶紫法评估生物膜抑制。通过分子对接预测来自BRP和BRS的18种选定植物成分与金黄色葡萄球菌（S. aureus）DNA旋转酶B和分选酶A的结合构象，分别针对抗菌和抗生物膜活性。
结果：FMSP-NPs呈球形，直径100–300 nm。在所有制剂中，FMSP-BRP表现出最高的抗菌活性，对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的MIC/MBC值为0.25/0.5 mg/mL，对金黄色葡萄球菌（S. aureus）为2/4 mg/mL，SEM观察到显著的细胞损伤。FMSP-BRP表现出最高的生物膜抑制率，对P. aeruginosa为65.1%，对S. aureus为59.2%，而FMSP-BRS为（49.6%、44.7%），FMSP-NPs为（39.7%、38.4%）。它显著降低了生物膜完整性、细菌定殖和胞外聚合物（EPS）基质形成。分子对接确定原花青素为最具活性的植物成分，对S. aureus DNA旋转酶B和分选酶A表现出最高的结合亲和力。这些发现凸显FMSP-BRP纳米复合物作为对抗耐药细菌感染的有前景候选物。
结论：这些发现支持木奶果（B. ramiflora）在感染性疾病中的传统应用，并强调了基于纳米技术的天然提取物在对抗AMR方面的潜力。
论文解读
一、研究背景与意义
抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）已成为21世纪全球公共卫生的重大威胁。抗生素在医疗、农业和畜牧业中的广泛过度使用和滥用，加速了细菌耐药性的快速升级。据预测，到2050年AMR每年可能导致超过1000万人死亡，累计经济负担超过100万亿美元。生物膜形成被确定为AMR的主要促成因素之一。生物膜是微生物嵌入自产胞外聚合物基质中形成的有结构群落，可增强细菌在不利条件下的生存能力。生物膜内细菌的耐药水平比浮游菌高10–1000倍，且许多生物膜相关微生物对抗生素、化学消毒剂和杀菌剂均具有耐药性。据美国国立卫生研究院（NIH）统计，约60%的微生物感染与生物膜形成相关。在临床环境中，植入物、导尿管和血液透析设备等医疗器械上的生物膜形成会导致严重并发症。
纳米技术已成为对抗细菌感染和克服生物膜相关耐药性的有前景途径。然而，目前抗菌纳米颗粒研究以金属和金属氧化物纳米颗粒体系（如TiO?、CuO、Ag和IONPs）为主，高浓度纳米颗粒可能产生细胞毒性。将纳米颗粒与植物提取物整合已被证明可在增强治疗效果的同时最大限度降低毒性。荧光磁性亚微米聚合物纳米颗粒（FMSP-NPs）是一类独特的基于聚合物的磁响应纳米颗粒，兼具磁性可回收性和荧光可追踪性优势，此前已在癌症治疗领域显示出与植物提取物联用的潜力，但尚未被探索作为植物化学物功能化的抗菌和抗生物膜平台。
木奶果（Baccaurea ramiflora Lour.），俗称缅甸葡萄，属于叶下珠科（Phyllanthaceae），果实富含维生素C、蛋白质和铁，其果皮和种子中含有饱和与不饱和脂肪酸、原花青素、酚类化合物、黄酮类和萜烯等植物化学成分。尽管已有研究证明其抗氧化和抗炎活性，但此前尚无研究评估其对耐药细菌病原体的抗菌或抗生物膜潜力，无论是单独使用还是与纳米颗粒载体联用。本研究首次将木奶果果皮和种子提取物与FMSP-NPs结合，针对多重耐药革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体进行抗菌和抗生物膜评价，并结合计算机模拟分子对接鉴定生物活性先导化合物。
二、主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：通过异相凝聚法合成FMSP-NPs，并利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）表征其形态和尺寸；采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；利用SEM观察处理前后细菌的形态学变化；采用结晶紫法在96孔微量滴定板上定量生物膜抑制率；利用SEM可视化生物膜结构变化；分子对接采用AutoDock-Vina软件，将18种选自木奶果果皮和种子的植物成分分别对接到金黄色葡萄球菌DNA旋转酶B（PDB ID: 4URM）和分选酶A（PDB ID: 1T2W）的活性位点。植物材料采集自孟加拉国拉杰沙希当地市场，并经分类学家鉴定，凭证标本存放于拉杰沙希大学植物学系（编号78，2022年2月10日）。细菌菌株为实验室保藏的MRSA和MDRPA菌株。
三、研究结果
纳米颗粒表征：TEM检测显示FMSP-NPs呈球形，直径范围100–300 nm。
MIC和MBC评估：对铜绿假单胞菌，FMSP-NPs、FMSP-BRP和FMSP-BRS的MIC值分别为1.27±0.25、0.26±0.01和0.63±0.15 mg/mL；对金黄色葡萄球菌，MIC值分别为4.07±0.21、2.0±0.2和3.90±0.1 mg/mL。对应的MBC值对铜绿假单胞菌为2.0±0.1、0.53±0.15和1.23±0.21 mg/mL，对金黄色葡萄球菌为8.0±0.2、4.23±0.25和8.13±0.15 mg/mL。FMSP-BRP在所有制剂中表现出最高的抗菌活性。
对细菌形态的影响：SEM分析显示，未经处理的铜绿假单胞菌细胞呈完整、光滑的杆状，金黄色葡萄球菌呈规则光滑的球形。经FMSP-NPs、FMSP-BRP和FMSP-BRS处理后，两种细菌均出现显著形态变化：铜绿假单胞菌表面粗糙、不规则，出现凹坑、凹陷和膜损伤；MRSA细胞表面不规则并伴有纳米颗粒黏附。其中FMSP-BRP诱导的细胞损伤最为广泛，表明其对革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体均具有优越的抗菌效果。
对生物膜形成的影响：所有纳米复合物均以剂量依赖性方式抑制生物膜形成。在0.125 mg/mL时，对铜绿假单胞菌的生物膜抑制率FMSP-BRP为19.4%、FMSP-BRS为16.2%、FMSP-NPs为11.9%，在2 mg/mL时分别增至65.1%、49.6%和39.7%。对金黄色葡萄球菌，FMSP-BRP在2 mg/mL时达到59.2%的抑制率，而FMSP-BRS为44.7%、FMSP-NPs为38.4%。FMSP-BRP表现出最高的抗生物膜活性。
生物膜结构可视化：SEM分析显示，未经处理的铜绿假单胞菌在玻璃盖玻片上形成致密聚集的生物膜，FMSP-NPs减少了细菌定殖和表面聚集并导致表面粗糙，FMSP-BRP和FMSP-BRS进一步破坏生物膜结构，可能通过损伤EPS层实现，其中FMSP-BRP表现出最强的抑制和显著的细胞膜损伤。金黄色葡萄球菌对照组生物膜表现出广泛的定殖，FMSP-NPs部分减少，FMSP-BRP和FMSP-BRS处理显著降低了生物膜细胞密度。
分子对接研究：针对抗菌活性，原花青素对金黄色葡萄球菌DNA旋转酶B的对接分数最高（-8.1 kcal/mol），优于共结晶对照配体XAM（-7.9 kcal/mol），其后依次为槲皮素（-7.8 kcal/mol）、绿原酸（-7.5 kcal/mol）、ramifloside（-6.7 kcal/mol）和咖啡酸（-6.4 kcal/mol）。原花青素通过常规氢键与Asp57、Glu58残基相互作用，通过疏水键与Asn54、Ser55、Leu60、Gly85、Ile86、Pro87残基相互作用，通过碳-氢键与Asp57相互作用，通过静电键与Asp57、Glu58、Arg84相互作用。针对抗生物膜活性，原花青素对金黄色葡萄球菌分选酶A的对接分数最高（-7.3 kcal/mol），优于对照LPETG肽（-7.1 kcal/mol），其后为绿原酸（-7.1 kcal/mol）、ramifloside（-6.9 kcal/mol）、槲皮素（-6.6 kcal/mol）和picrotoximaesin（-6.0 kcal/mol）。原花青素通过常规氢键与Ala92、Glu105、Ser116、Gln172、Arg197残基相互作用，通过疏水键与Ala104、Ala118、Ile182、Val193相互作用，通过静电键与Glu105、Arg197相互作用。
四、讨论与结论
讨论部分指出，纳米颗粒的抗菌活性随粒径减小而增强，较小的纳米颗粒可通过自由基产生和离子扩散更有效地穿透细菌细胞。革兰氏阴性铜绿假单胞菌比革兰氏阳性金黄色葡萄球菌对测试纳米颗粒更敏感，这可能归因于细胞壁组成差异：革兰氏阳性菌具有厚而坚固的肽聚糖层（20–80 nm）提供更强保护，而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄（7–8 nm），外层覆盖高度带负电荷的脂多糖层，有利于与纳米颗粒的更强相互作用，促进黏附及随后的膜破坏。FMSP-BRP纳米复合物对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生物膜抑制率分别为65.1%和59.2%。分子对接为木奶果提取物中植物成分的贡献提供了靶点特异性机制见解：分选酶A是一种转肽酶，将LPXTG基序表面黏附素锚定到细胞壁，与细菌黏附和生物膜起始机制相关；DNA旋转酶B是II型拓扑异构酶，通过负超螺旋对DNA复制和修复必不可少，是直接的抗菌靶点。原花青素对两个靶点均表现出最高对接分数，超过各自共结晶对照配体的结合亲和力，与FMSP-BRP增强活性的实验观察一致。
研究结论：将木奶果果皮（BRP）和种子（BRS）提取物与FMSP-纳米颗粒结合，可增强对多重耐药铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗菌和抗生物膜活性，优于单独使用FMSP-NPs。FMSP-BRP纳米复合物通过更低的MIC/MBC值、显著的细菌膜损伤以及明显的生物膜和EPS基质破坏表现出最强效果。分子对接确定原花青素为对金黄色葡萄球菌DNA旋转酶B和分选酶A结合亲和力最高的植物成分，提示其是观察到的生物活性的关键贡献者。该研究存在局限性：抗菌和抗生物膜发现基于使用单一参考MDRPA/MRSA菌株的体外实验；原花青素及其他成分的对接预测未通过分离纯化确认；未评估纳米复合物对哺乳动物细胞的细胞毒性或生物相容性。未来工作应聚焦于体内效力和毒性研究、针对更广泛的临床MDR分离株测试、木奶果植物成分的分离和结构确认，以及靶点结合的实验验证，以支持FMSP-BRP作为纳米复合物抗菌和抗生物膜治疗候选物的开发。
