《Conservation Genetics Resources》：Genome assembly and diagnostic DNA markers for sex of the largest freshwater fish in North America, the white sturgeon (Acipenser transmontanus)
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白鲟（Acipenser transmontanus）作为北美最大的淡水鱼类，其演化谱系经历了至少两轮全基因组复制事件，并可能同时表现出二价与多价减数分裂分离模式。该物种还因自发同源多倍化而存在当代倍性变异。然而，由于多个种群片段长期面临补充失败，保护性水产养
白鲟（Acipenser transmontanus）作为北美最大的淡水鱼类，其演化谱系经历了至少两轮全基因组复制事件，并可能同时表现出二价与多价减数分裂分离模式。该物种还因自发同源多倍化而存在当代倍性变异。然而，由于多个种群片段长期面临补充失败，保护性水产养殖已成为其管理的重要组成部分。为促进遗传工具的开发以助力白鲟保护，研究人员呈现了一份来自美国爱达荷州斯内克河白鲟个体的基因组组装。用于组装的序列数据分析表明，单倍体基因组大小约为1.5 Gbp，暗示相对于假定的鲟形目祖先呈八倍体（8 N）；而对21至41 bp杂合k-mer的分析则提示该基因组同时反映了四倍体（4 N）与八倍体（8 N）变异。最终基因组组装利用两个F1家系构建的连锁图谱进行支架搭建，包含832,145个支架，总长6.26 Gbp，与已发表的基因组大小估计一致。该基因组的保守直系同源基因完整性较高（90.5%；其中22.8%为单拷贝，67.7%为重复），基于连锁图谱的最大支架长度为55.2 Mbp，然而组装N50仅为416 Kbp，表明组装仍较为碎片化。研究人员通过鉴定与性别显著关联的基因组区域，展示了该组装的实用性。设计用于纳入扩增子分型检测组的遗传标记对雌性与雄性性别的预测正确率分别为96.6%和81.5%，呈现出较强的总体关联性（P = 0.0054），但不同地理区域间存在一定差异。
一、研究背景与科学问题
鲟形目鱼类常被称为“活化石”，是辐鳍鱼纲中较早分化的分支，骨骼弱骨化且多为软骨。尽管形态保守，但其核型经历了多次全基因组复制事件。白鲟（Acipenser transmontanus）是北美最大的淡水鱼，历史上体长可达4米以上，分布于从加利福尼亚到阿拉斯加的太平洋沿岸水域。然而，目前仅存三个已知的自维持种群，分别位于萨克拉门托-圣华金河、弗雷泽河和哥伦比亚河流域。由于过度捕捞、水电站建设导致的栖息地破碎化和补充失败，白鲟多个种群片段面临严重威胁，保护性水产养殖成为其管理的重要手段。
白鲟基因组极为复杂：其核型约有270条染色体（含大量微染色体），相对于约120条染色体的功能二倍体鲟类，白鲟被认为是功能四倍体（4 N），相对于鲟形目祖先则为祖先八倍体（8 N）。此外，人工养殖和自然群体中还偶发自发同源多倍化现象，产生六倍体（6 N）个体及其回交后代五倍体（5 N）。这种复杂的倍性背景使得遗传工具的开发和分子标记的应用极具挑战。已有研究表明白鲟为雌性异配型性别决定系统（ZW型），但性别决定的具体机制尚不明确。因此，构建高质量的基因组参考序列并开发可靠的性别鉴定标记，对于优化保护性水产养殖策略、维持合理的性别比例和遗传多样性至关重要。
二、研究目的
为了提供白鲟保护的基因组资源，研究人员开展了本项研究，旨在：1）构建白鲟的基因组组装；2）开发可用于早期性别鉴定的分子标记；3）评估这些标记在不同地理种群中的预测效能。
三、主要关键技术方法
- 1.
测序与基因组组装：采集一条来自美国爱达荷州斯内克河的成年雌性白鲟的全血样本，提交给NRGene公司进行双端测序、mate-pair（邻近连接）测序和10X Chromium（微流控片段条形码）测序。使用DeNovoMAGIC v3组装器进行定相（等位基因）基因组组装，预期在多倍体基因组中产生单倍体而非二倍体组装。
- 2.
基因组大小与倍性评估：利用Genomescope和Smudgeplot软件，基于jellyfish和FastK计数的k-mer（k=21、23、31、41 bp）分析估计单倍体基因组大小和倍性状态。
- 3.
F1家系构建与变异检测：构建了两个F1家系——弗雷泽河家系（采用限制性位点关联DNA测序RADseq）和斯内克河家系（采用信使RNA测序RNAseq），分别进行SNP检测。弗雷泽河家系使用紫外线照射精子与雌鱼卵受精产生母系单倍体后代，并通过Coulter计数器区分母系单倍体和正常二倍体后代。
- 4.
连锁图谱构建与支架锚定：利用JoinMap5软件，基于“母系单倍体”RADseq数据、“父+母”RADseq数据和RNAseq数据分别构建高置信度连锁图谱，再通过Allmaps工具将初始组装支架锚定到连锁图谱上，优先使用母系单倍体图谱。
- 5.
性别相关标记开发与验证：比对白鲟组装与已发表的小体鲟（Acipenser ruthenus）雌雄基因组，提取性别特异性区域，通过blastn搜索在白鲟中鉴定出同源序列。在Z/W同源区（zwhr）和W特异性区（p455160ex）设计两个小型扩增子（<100 bp），整合到GT-seq多重分型体系中，对来自五个不同种群的已知性别个体进行验证。
四、研究结果
1. 基因组大小与倍性估计
Genomescope分析显示，测序个体的单倍体基因组大小约为1.514–1.622 Gbp，取决于假设的倍性（2–4 N）和k-mer长度。Smudgeplot分析表明，测序个体的基因组主要表现为四倍体特征，同时含有较少比例的八倍体信号。较长的k-mer（如41 bp）主要捕获近期复制事件的产物，而较短的k-mer则反映更古老的复制事件。
2. 基因组组装质量
初始组装contig总大小为5.96 Gbp，经支架搭建后为6.26 Gbp（含4.86%缺口），另有826 Kbp序列未能纳入组装。组装N50仅为339 Kbp（3,870个序列），最大支架8.59 Mbp，远小于小体鲟RefSeq组装的染色体级支架。但Compleasm评估显示，白鲟组装的保守直系同源基因完整性达90.5%（缺失率6.1%），与小体鲟（96.7%，缺失率3.3%）差距不大，两者均表现为高比例重复基因（67.7% vs. 68.9%）。
3. 连锁图谱构建与支架锚定
母系单倍体RADseq图谱产生了接近预期染色体数目（1n≈135）的连锁群，平均重组率为每连锁群每次减数分裂0.5个重组事件。RNAseq图谱则高估了重组率。通过优先使用母系单倍体图谱进行锚定，最终组装的N50提升至416 Kbp（1,976个支架），最大支架达到55.2 Mbp。
4. 与小体鲟基因组的比较
白鲟组装的大支架与小体鲟染色体水平支架显示出清晰的同源性，多数小体鲟染色体对应两个白鲟支架，反映了谱系特异性全基因组复制后的衍生旁系同源关系。例如，白鲟支架1和5共同对应于小体鲟3号染色体。白鲟自身比对未发现明显的大规模旁系同源对应关系，表明两次多倍化事件后发生了显著的序列分化。连锁不平衡分析显示，这些旁系同源染色体基本独立分离，仅有少数例外。
5. 性别鉴定标记的开发与验证
通过比对小体鲟的性别特异性区域，在白鲟中鉴定出两个假定的Z染色体支架（1和5）和一个假定的W染色体支架（仅108 Kbp，未被连锁图谱捕获）。在Z/W同源区内设计了一个共享标记（zwhr），在相邻不可比对区域内设计了W特异性存在/缺失标记（p455160ex）。验证结果显示，两个标记严格连锁，W特异性单倍型在携带个体中约占该位点测序读数的1/4（均值0.251，标准差0.023）。整体而言，标记对雌性的预测正确率为96.2%，对雄性为81.5%，与性别的总体关联性极强（P=0.0054）。但不同种群间存在差异：下哥伦比亚河种群准确率达100%（雌雄均为100%），而萨克拉门托盆地雄性中出现W特异性标记的比例偏高（56%），其他种群则表现出中等水平的准确性。
五、讨论与结论
本研究为白鲟提供了新的基因组资源，将有助于这一濒危物种的保护及相关多倍体脊椎动物基因组进化机制的研究。尽管当前的组装因高倍性和高度旁系同源性而较为碎片化，但基因含量评估表明其已包含大部分鲟类基因信息，适用于多种基因组依赖的遗传学研究。
通过利用该组装，研究人员成功鉴定了与其他鲟类性别特异性区域高度同源的基因组区域，并开发了两个分子标记。这些标记可整合到多重GT-seq分型体系中，也可改造为独立的qPCR或可视化检测方法（例如以zwhr作为阳性对照，通过p455160ex的存在与否判断雌性，预期雌性中两个扩增子的浓度比约为1:4）。
然而，研究人员强调在实际应用中需谨慎，建议在各白鲟种群中使用已知性别个体先行验证标记的关联性。标记与性别的关联强度在不同种群间存在差异，可能的原因包括：（1）标记所在区域可能与真正的性别决定位点存在连锁而非因果关系；（2）两个推定Z染色体之间存在残余重组，可能削弱标记与性别决定位点的关联；（3）鲟类的性别决定可能是多基因控制的；（4）不能完全排除环境因素对性别决定的影响。
综上所述，本研究成功构建了白鲟的基因组草图，并基于此开发了有效的性别诊断分子标记，为保护性水产养殖中的性别管理提供了实用工具。未来需要采用长读长测序和Hi-C文库等更先进的测序技术来进一步解析白鲟的多倍体基因组结构，同时有必要构建涵盖不同种群和性别的“泛基因组”，以全面反映该物种的基因组变异。
