《Discover Animals》：Transcriptomic adaptation of Litopenaeus vannamei to biofloc conditions in an indoor aquaculture system
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虾类养殖是全球海产品生产的关键领域，然而环境应激因素会对虾类代谢与免疫产生不利影响。生物絮团技术（Biofloc Technology, BFT）通过絮团中微生物聚集体的形成应对上述挑战，但其潜在的分子机制仍知之甚少。本探索性研究评估了在室内多营养级养殖系统（
虾类养殖是全球海产品生产的关键领域，然而环境应激因素会对虾类代谢与免疫产生不利影响。生物絮团技术（Biofloc Technology, BFT）通过絮团中微生物聚集体的形成应对上述挑战，但其潜在的分子机制仍知之甚少。本探索性研究评估了在室内多营养级养殖系统（Indoor Multi-Trophic Aquaculture System, IMTAS）中养殖的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）中肠组织的转录组变化。研究将两种BFT处理（GRG1和GRG2）与非BFT对照组进行比较。对测序所得中肠RNA进行了差异表达分析、层次聚类分析和KEGG通路富集分析。在GRG1与对照组比较中鉴定出1245个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），在GRG2与对照组比较中鉴定出1145个DEGs，在GRG1与GRG2比较中鉴定出681个DEGs。研究观察到处理特异性表达谱，GRG1和GRG2与对照组分别聚类。GRG1与对照组富集通路包括蛋白酶体、自噬和吞噬体，表明蛋白质周转和免疫功能增强。GRG2与对照组富集了氨酰-tRNA生物合成和内质网加工通路，反映适应性代谢响应。氧化磷酸化在两个生物絮团处理间差异富集，提示处理特异性能量代谢差异。GRG1中与蛋白质周转、免疫调节和能量代谢相关通路的更高富集可能与其更高的生产性能相关。这些探索性发现为未来针对生物絮团介导效应分子机制的假设驱动研究奠定了基础，但需通过qPCR验证以确认所观察到的转录组模式。
论文解读：凡纳滨对虾在室内养殖系统生物絮团条件下的转录组适应
一、研究背景与目的
虾类养殖在全球海产品供给中占据重要地位，贡献超过50%的全球虾类供应量。然而，该产业面临水体质量恶化、氨氮升高等环境应激因子的严重挑战，这些因子可损害对虾生理功能，表现为生长迟缓、疾病易感性和死亡率上升。凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）因其生长快速且适应0.5–40 ppt的广盐度范围，占全球养殖对虾产量的约80%。环境应激会诱导对虾启动耗能过程，如低盐胁迫下的离子调节、温度波动导致的内分泌紊乱和酶活性受损，以及氨氮与血蓝蛋白竞争结合氧所引发的呼吸窘迫、氧化应激和免疫抑制。生物絮团技术（BFT）通过微生物聚集体形成絮团，可降低氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐水平，减少水交换量，并通过免疫刺激化合物增强对虾抗病力。已有研究报道BFT可提高对虾生长速率20%–30%，并调节氨酰-tRNA生物合成、自噬等转录组响应。然而，大多数研究聚焦于表型结果，对组织特异性转录组响应的探究有限，制约了BFT方案的优化。为此，研究人员在室内多营养级养殖系统（IMTAS）中开展研究，该系统整合了BFT、絮凝和植物修复于一个自动化闭环框架中。研究设置了GRG1和GRG2两种BFT处理组，并与非BFT对照组比较，旨在表征中肠组织的差异基因表达和富集通路。
二、研究方法概述
该研究于2023年8月2日至10月17日在马来西亚登嘉楼大学热带水产养殖与渔业研究所（AKUATROP）室内孵化场开展。前期实验采用田口L9正交阵列和灰色关联分析（GRA）优化了放养密度、碳氮比（C/N）和益生菌剂量，确定了GRG1（200尾/m3，C/N=10:1，14 ml/L益生菌）和GRG2（200尾/m3，C/N=20:1，7 ml/L益生菌）两种处理，并转移至IMTAS框架中。IMTAS包含对虾养殖单元、絮凝单元（垂直旋流塔和UV）及植物修复单元（蕨藻Caulerpa吸收营养），水循环由物联网系统控制。实验设对照组（非BFT，每日2.5%水交换）、GRG1和GRG2三组，每组三个重复。对虾幼体（PL）来自马来西亚彭亨州供应商，经应激测试（存活率87%）后以200尾/m3放养，投喂Blanca?对虾饲料（粗蛋白36%）。经12周养殖后，从每个重复池取样三只对虾中肠组织，经液氮速冻后于-80°C保存。RNA提取采用TRIzol试剂，RNA纯度（A260/A280比值1.8–2.0）经NanoDrop 2000检测，完整性（RIN≥7.0）经Agilent 2100 Bioanalyzer验证。文库采用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit制备，在Illumina NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序（每样本至少6 Gb）。原始读段经FastQC质控、Trimmomatic修剪，使用HISAT2比对到L. vannamei参考基因组（GenBank: GCA_042767895.1），并用StringTie定量为FPKM。差异表达分析使用DESeq2（v1.30.0），以|log2(FoldChange)|≥1且校正后p值≤0.05为阈值。功能富集分析采用ClusterProfiler（v4.0）靶向KEGG通路，Benjamini-Hochberg方法控制错误发现率（FDR），通路富集条件为含超过10个DEGs、基因比率超过50%且padj≤0.05。生长性能指标包括平均终重（MFW）、特定生长率（SGR）、饲料转化率（FCR）、条件因子（CF）和存活率。
三、研究结果
1. 养殖环境水质条件
三种处理的大多数水质参数存在显著差异。与对照组相比，GRG1和GRG2的总氨氮（TAN）、亚硝酸盐和磷酸盐浓度显著降低（p<0.05），溶解氧显著升高，电导率、总溶解固体和盐度显著降低，pH显著升高。温度在三组间无显著差异。
2. 生长指标变化
GRG1的平均终重最高（21.45 g），对照组最低（10.50 g）。GRG1的特定生长率（4.79 g day?1）、饲料转化率（1.05）、条件因子（1.50）和存活率（75.91%）均显著优于对照组（SGR 3.96 g day?1，FCR 1.39，CF 1.03，存活率49.08%），且差异具有统计学意义（p<0.01）。
3. 处理间差异表达基因与共表达
GRG1与对照组比较鉴定出1245个DEGs（793个上调，452个下调）；GRG2与对照组比较鉴定出1145个DEGs（729个上调，416个下调）；GRG1与GRG2比较鉴定出681个DEGs（414个上调，267个下调）。韦恩图显示GRG1和GRG2共有530个重叠基因，两者与对照组分别有250和271个共同基因，三种处理共享4393个基因。
4. 转录组聚类与降维
基于Z-score标准化FPKM值的层次聚类热图显示，GRG1和GRG2样本聚在一起，并与对照组分离，表明处理特异性表达模式。主成分分析（PCA）进一步确认了组间变异和组内重复一致性。
5. DEGs功能富集
GRG1与对照组显著富集三条KEGG通路：蛋白酶体（ko03050）、自噬-动物（ko04140）和吞噬体（ko04145）。GRG2与对照组富集氨酰-tRNA生物合成（ko00970）和内质网蛋白质加工（ko04141）。GRG1与GRG2比较富集氧化磷酸化（ko00190）。
6. 处理比较中观察到的DEGs通路
（1）GRG1 vs. 对照组
蛋白酶体通路中，26S蛋白酶体调节颗粒PA700（Lid）亚基（Rpn5、Rpn6、Rpn7、Rpn8、Rpn10、Rpn11）功能评分为3，PA（Base）亚基（Rpn2、Rpt1）评分为3，20S核心颗粒β4评分为4，表明蛋白降解能力增强。自噬通路中，TSC1和AMPK上调4倍，ULK1/2上调4.3倍，LC3上调5倍，ATG2和ATG9L上调4倍，BNIP3上调3.2倍，mTOR上调3.3倍，Rab1a上调2.5倍，而VMP1下调-2.5倍。吞噬体通路中，微管蛋白α（TUBA）和微管蛋白β（TUBB）分别上调10倍和5倍，肌动蛋白α/γ1、VPS34、组织蛋白酶L和整合素上调5倍，血小板反应蛋白（TSP）上调22倍。
（2）GRG2 vs. 对照组
氨酰-tRNA生物合成通路中，丙氨酰-tRNA合成酶（EC:6.1.1.7）上调1倍，而谷氨酰胺-tRNA合成酶（EC:6.1.1.18）、天冬氨酰-tRNA合成酶（EC:6.1.1.12）和甘氨酰-tRNA合成酶（EC:6.1.1.14）分别下调-3、-3和-2倍。内质网蛋白质加工通路中，Sec23/24上调5倍，热休克蛋白Hsp70和Hsp40上调4倍和2倍，ERAD相关因子UBX、p97和ufd1上调2倍、3倍和3倍；而钙联蛋白（CNX）、BiP、Hsp40和eIF2α分别下调2倍、4倍、4倍和5倍，ASK1上调2倍。
（3）GRG1 vs. GRG2
氧化磷酸化通路中，NADH脱氢酶亚基（ND3、ND4、ND4L、ND5、Ndufs3、Ndufv2）分别上调2、1、1、1、2和4倍，V型ATP酶亚基D上调2倍；而细胞色素C氧化酶亚基（COX5B、CYC）分别下调-2和-1倍。
四、讨论与结论
研究人员观察到生物絮团处理组水质显著改善，氮废物的降低和溶解氧的升高为转录组调节提供了有利环境。GRG1中蛋白酶体、自噬和吞噬体通路的富集表明蛋白质周转、应激响应和免疫功能增强，这与其最高的生长和存活性能一致。GRG2中氨酰-tRNA生物合成和内质网加工的调节反映了对高C/N比条件的代谢适应。氧化磷酸化在两种BFT处理间的差异富集表明能量代谢存在处理特异性差异。这些发现为理解BFT改善对虾生产性能的分子机制提供了基础，但存在一定局限性：对照组在水交换制度上与BFT处理不同，可能混杂了水管理效应；未检测生理免疫参数；未进行qPCR验证。研究人员在结论中指出，GRG1中蛋白酶体组分和自噬相关基因的表达上调提示蛋白质周转、免疫应答和细胞应激管理的增强，可能促成了其优越的生长和存活表现。该研究为优化基于生物絮团的对虾养殖系统、提高生产力和可持续性提供了分子层面的依据。
