《Journal of Natural Medicines》：Ginsenoside Rd promotes the expression of acetylated α-tubulin and FOXJ1 in human bronchial epithelial cells
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黏液纤毛清除（mucociliary clearance, MCC）是气道的一种防御机制，由黏液与运动纤毛的协调功能驱动。尽管纤毛摆动频率（ciliary beat frequency, CBF）反映了纤毛细胞的运动功能，但纤毛细胞的生成与维持对于持续的气道上
黏液纤毛清除（mucociliary clearance, MCC）是气道的一种防御机制，由黏液与运动纤毛的协调功能驱动。尽管纤毛摆动频率（ciliary beat frequency, CBF）反映了纤毛细胞的运动功能，但纤毛细胞的生成与维持对于持续的气道上皮防御同样至关重要。虽然短期使用人参皂苷Rd（ginsenoside Rd, Rd）可提高CBF，但其对人气道上皮细胞分化的长期影响仍不清楚。研究人员在空气-液体界面（air-liquid interface, ALI）条件下培养原代正常人支气管上皮（normal human bronchial epithelial, NHBE）细胞，研究了Rd的作用。第10天时，Rd增加了乙酰化α-微管蛋白（acetylated α-tubulin, Ac-α-tubulin）阳性细胞的百分比，而MUC5AC阳性细胞的百分比保持不变。Rd促进了Ac-α-tubulin阳性细胞随时间依赖性增加，而乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放及总细胞数未见显著变化。长期Rd处理不影响基线CBF。此外，灌注Rd可提高CBF，且该效应与分化条件无关。这些观察结果表明，长期Rd处理引起的Ac-α-tubulin阳性细胞增加与短期Rd处理引起的CBF升高在功能上可能是可分离的。ERβ抑制剂及CREB依赖性转录抑制剂可抑制Ac-α-tubulin阳性细胞百分比的增加。Rd还增加了FOXJ1 mRNA转录本的表达。这些发现提示，Rd可能调节人气道上皮细胞中纤毛细胞标志物（如乙酰化α-微管蛋白和FOXJ1）的表达以及纤毛运动功能。
论文解读：人参皂苷Rd调控人气道上皮纤毛细胞标志物表达及纤毛运动功能的研究
研究背景与目的
气道黏液纤毛清除系统（mucociliary clearance, MCC）是呼吸道抵御吸入性病原体和环境颗粒的重要防御机制，其功能依赖于分泌细胞产生的黏液与纤毛上皮细胞运动纤毛的协调作用。纤毛摆动频率（ciliary beat frequency, CBF）被广泛用作评估纤毛功能与MCC的指标。长期维持和激活MCC不仅需要提高CBF，还需要促进上皮细胞向纤毛细胞分化。然而，目前针对促进或调节纤毛上皮分化的药理学手段仍较为有限。人参皂苷Rd（ginsenoside Rd, Rd）是从人参中提取的一种具有生物活性的皂苷，研究团队前期已报道Rd和17β-雌二醇可通过雌激素受体β（estrogen receptor β, ERβ）提高小鼠气道纤毛细胞的CBF，但其对人气道上皮细胞分化的长期影响尚不清楚。ERβ信号通路在猪输卵管和人子宫内膜类器官中已被证实参与纤毛细胞分化调控，但在气道中的作用尚未充分阐明。基于此，研究人员提出假设：ERβ相关信号可能促进人气道上皮向纤毛细胞分化，并利用原代正常人支气管上皮（normal human bronchial epithelial, NHBE）细胞在空气-液体界面（air-liquid interface, ALI）培养条件下，系统研究了Rd对纤毛细胞标志物乙酰化α-微管蛋白（acetylated α-tubulin, Ac-α-tubulin）和FOXJ1表达以及CBF的影响。
研究方法概述
研究人员从美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）获得一名男性（18岁，白人，无吸烟史）的NHBE细胞，并在ALI条件下进行分化培养。主要技术方法包括：免疫荧光染色及定量分析，用于检测Ac-α-tubulin、MUC5AC、FOXJ1、ERα、ERβ及G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor, GPER）的表达和阳性细胞比例；高速显微成像系统用于测量CBF；逆转录定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR, RT-qPCR）用于检测FOXJ1、MCIDAS、CCNO、HES1等分化相关基因的mRNA表达水平；药理学干预实验使用ERβ拮抗剂PHTPP、GPER拮抗剂G15及CREB/CBP依赖性转录抑制剂compound 3i，以解析信号通路机制。所有实验均采用5个独立insert，数据以均值±标准误表示。
研究结果
（1）ALI培养条件下NHBE细胞分化及纤毛运动功能的验证
研究人员将NHBE细胞在ALI条件下培养21天，免疫荧光染色确认Ac-α-tubulin阳性细胞占62.7%±4.7%，MUC5AC阳性细胞占7.1%±1.7%，与既往正常人气道上皮研究结果一致。分化纤毛细胞的基线CBF为9.1±1.8 Hz，腺苷酸环化酶激活剂毛喉素（forskolin, 10 μM）处理后CBF显著升高，相对增幅为24.4%±4.3%，证实该模型具有功能性的药理学反应性，适合用于本研究。
（2）Rd对Ac-α-tubulin阳性细胞比例的浓度依赖性调节
在ALI培养起始时给予不同浓度（1、3、10、30 μM）Rd处理10天，发现10 μM Rd显著增加Ac-α-tubulin阳性细胞比例，而1、3 μM无显著效果，30 μM时该效应减弱。在vehicle至10 μM浓度范围内，线性趋势分析显示斜率显著为正，提示Rd在该浓度区间内呈浓度依赖性促进纤毛细胞标志物表达。Rd对MUC5AC阳性细胞比例无明显影响，表明其作用具有细胞类型选择性。
（3）Rd促进Ac-α-tubulin阳性细胞随时间依赖性增加
在ALI培养第14天和第21天，10 μM Rd均显著增加Ac-α-tubulin阳性细胞比例，且不改变MUC5AC阳性细胞比例。双因素方差分析显示，培养时间和Rd处理均显著影响Ac-α-tubulin阳性细胞比例，且两者存在显著交互作用。斜率分析显示，Rd组Ac-α-tubulin阳性细胞比例的增长速率（6.9%/天）显著快于vehicle组（5.7%/天）。第21天乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放和Hoechst 33342阳性细胞总数在Rd处理后均无显著变化，提示Rd的效应并非由细胞毒性或细胞总数变化所致。
（4）Rd处理时间对CBF的差异性影响
研究人员采用2×2实验设计，分别考察长期Rd培养处理和短期Rd灌注对CBF的影响。双因素方差分析显示，培养条件与灌注条件之间无显著交互作用；长期Rd处理组与vehicle处理组的基线CBF无显著差异，而无论分化条件如何，额外灌注Rd均显著提高CBF。这表明长期Rd处理引起的Ac-α-tubulin阳性细胞增加与短期Rd处理引起的CBF升高可能通过不同的机制发挥作用。
（5）ERβ信号参与Rd诱导的Ac-α-tubulin阳性细胞增加
第21天免疫荧光染色检测到NHBE细胞表达ERβ和GPER，但未检测到ERα。在Rd存在的情况下，选择性ERβ拮抗剂PHTPP（10 μM）显著抑制Ac-α-tubulin阳性细胞比例的增加；而选择性GPER拮抗剂G15（1 μM）无显著影响。这些药理学证据提示ERβ相关信号而非GPER信号介导了Rd对纤毛细胞标志物的促进作用。
（6）Rd对纤毛细胞分化相关基因表达的影响
RT-qPCR结果显示，Rd在ALI培养第10、14、21天均显著增加FOXJ1 mRNA表达；MCIDAS mRNA表达在各时间点均无明显变化；CCNO mRNA仅在21天时显著升高。Rd对ALI培养第1、3、5天的HES1 mRNA表达无显著影响。第14天免疫荧光染色确认Rd显著增加FOXJ1阳性细胞比例。上述结果表明，Rd诱导的Ac-α-tubulin阳性细胞增加伴随FOXJ1表达上调，但对上游纤毛生成转录程序及经典Notch-HES1信号通路的影响较小。
（7）CREB/CBP依赖性转录参与Rd的作用
基于Rd可提高cAMP以及CREB参与呼吸道分化的既往报道，研究人员使用CREB/CREB结合蛋白（CREB-binding protein, CBP）依赖性转录抑制剂compound 3i（0.5 μM）与Rd共处理10天。结果显示，compound 3i显著抑制Rd诱导的Ac-α-tubulin阳性细胞比例增加，提示CREB/CBP依赖性转录可能参与该过程。
总结与结论
本研究表明，Rd可通过ERβ相关信号及CREB/CBP依赖性转录途径，上调FOXJ1和Ac-α-tubulin等纤毛细胞标志物的表达，从而促进人气道上皮细胞向纤毛细胞分化；同时，短期Rd处理可快速提高CBF，且这两种效应在机制上存在可分离性。该研究为通过药理学手段调控纤毛细胞分化以改善MCC提供了新思路。研究存在的局限性包括：缺乏体内实验验证，ALI培养体系难以完全模拟多细胞气道微环境；Ac-α-tubulin作为单一标志物尚不能全面反映纤毛的结构成熟度和功能完整性；Rd的人体药代动力学数据仍在I期临床试验阶段，其可达组织浓度与疗效的相关性有待进一步明确。未来需通过体内模型、纤毛形态学分析及黏液纤毛传输功能检测等方法，进一步阐明Rd的临床转化潜力。
