基于水疱性口炎病毒（VSV）的假型系统用于研究狒狒α疱疹病毒2型（PaHV-2）的入侵与中和

《Scientific Reports》：A VSV-based pseudotyping system for studying entry and neutralization of papiine alphaherpesvirus 2

　　

：非人灵长类动物的单纯疱疹病毒（Simplexvirus）在引起人类严重疾病的能力上存在差异。狒狒的狒狒α疱疹病毒2型（Papiine alphaherpesvirus 2, PaHV-2）尚未有报道称其可致人类致病，而人类感染猕猴α疱疹病毒1型（Macacine alphaherpesvirus 1, McHV-1，即疱疹B病毒）则可导致致命性疾病。为研究PaHV-2进入细胞的机制，研究人员建立了一种基于水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV）的假型系统。为此，研究人员克隆了编码PaHV-2核心糖蛋白gD、gH、gL和gB以及gC的基因，并将这些糖蛋白分别配备天然信号肽或异源信号肽及表位标签。携带Igκ信号肽的糖蛋白表达最为稳定，并能有效掺入假型VSV颗粒中。携带核心糖蛋白（DHLBpp）或扩展糖蛋白组合（DHLBCpp）的VSV假病毒能高效进入多种来源于人、恒河猴、非洲绿猴和小鼠的细胞系。此外，DHLBpp能被狒狒血清高效中和，其中和水平与使用PaHV-2报告病毒测定的结果相当。总之，携带PaHV-2糖蛋白的VSV颗粒是研究PaHV-2入侵及中和作用的新型工具。

论文解读：

一、研究背景与意义

单纯疱疹病毒（Simplexvirus）与其各自宿主物种共同进化，具有相似的生物学特性。原发感染后，病毒通常无症状，并在感觉神经节中建立终身潜伏感染，偶有再激活导致无症状排毒或皮肤黏膜局部病变。单纯疱疹病毒的一个重要特征是宿主范围广泛，可导致跨物种传播，进而可能引发严重疾病。值得注意的是，猕猴α疱疹病毒1型（McHV-1，疱疹B病毒）从恒河猴传播至人类常导致严重脑炎，而由HSV-1引起的脑炎则较为罕见，且通常与先天免疫基因缺陷相关。与McHV-1密切相关的狒狒α疱疹病毒2型（PaHV-2）尚未有感染人类致病的报道，目前尚不清楚这些病毒在人类神经毒力方面存在差异的原因。PaHV-2是狒狒中自然流行的病毒，成年动物血清阳性率约为90%，多在幼年（6个月至4岁）通过口腔或性接触传播，其自然感染过程与HSV-1在人类中的感染相似。PaHV-2与猕猴α疱疹病毒2型（CeHV-2）亲缘关系最近，且具有广泛的物种嗜性。许多PaHV-2毒株与McHV-1相似，对小鼠具有神经致病性，但不同于CeHV-2。为深入理解单纯疱疹病毒神经毒力差异的分子机制，需要建立用于比较分析的系统。基于VSV的假型系统已被广泛用于研究多种高致病性病毒的入侵、嗜性和中和作用。由于单纯疱疹病毒依赖四种糖蛋白（gD、gH、gL、gB）协同介导入侵过程，其假型系统的建立更具挑战性。目前，针对HSV-1和McHV-1的VSV假型系统已有报道，但尚无针对与McHV-1密切相关的PaHV-2的类似系统。本研究旨在建立PaHV-2的VSV假型系统，以分析其细胞入侵及中和抗体的阻断作用。

二、研究内容与结论

研究人员建立了基于VSV的PaHV-2假型系统。首先克隆了人源密码子优化的PaHV-2糖蛋白gD、gH、gL、gB和gC基因，并构建了三种表达系统：全长糖蛋白（fl）、前胰蛋白酶信号肽-Flag标签（LFlag）以及Igκ信号肽-HA标签（pDisplay）。通过免疫印迹和流式细胞术分析发现，pDisplay系统能实现所有五种糖蛋白的稳定表达和细胞表面定位，其中gH/gL异源二聚体的表面表达依赖于两者的共表达。假病毒颗粒分析表明，核心糖蛋白gD、gH、gL和gB可掺入VSV颗粒中。入侵实验证实，携带核心糖蛋白的DHLB_pp能高效进入多种人类和非人灵长类细胞系，且gD和gB为入侵所必需。细胞嗜性分析显示，不同细胞系间入侵效率存在高达100倍的差异，而gC的加入可显著增强PaHV-2_pp对SH-SY5Y和LR-7细胞的入侵效率。中和实验表明，PaHV-2_pp能有效被狒狒血清中和，其中和效价与报告病毒测定结果相当，且结果具有良好的可重复性。该研究成功建立了PaHV-2的VSV假型系统，为研究PaHV-2的入侵机制、细胞嗜性及中和抗体检测提供了新型工具，有助于深入理解不同单纯疱疹病毒神经毒力差异的分子基础。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：1）人源密码子优化的PaHV-2糖蛋白基因合成与克隆，通过Gibson组装构建至pCAGGS载体，并构建了fl、LFlag和pDisplay三种表达系统；2）基于复制缺陷型VSV（VSV^?ΔG-fLuc）的假病毒生产系统，在293T细胞中共转染糖蛋白表达质粒和VSVΔG基因组；3）免疫印迹分析检测糖蛋白表达及假病毒颗粒中糖蛋白的掺入情况；4）流式细胞术分析糖蛋白的细胞表面表达；5）假病毒入侵实验，通过荧光素酶报告基因定量检测不同细胞系的入侵效率；6）中和抗体检测实验，使用来自狒狒（Papio hamadryas）的血清样本评估假病毒中和效价，并与PaHV-2-cmvGluc报告病毒结果进行比较。

四、研究结果

（一）PaHV-2糖蛋白的克隆与表达

研究人员将人源密码子优化的PaHV-2糖蛋白基因克隆至pCAGGS载体，并构建了三种表达系统。免疫印迹分析显示，pDisplay系统（Igκ信号肽-HA标签）能实现所有五种糖蛋白的稳定表达，而全长和LFlag系统的gH、gL和gC表达较弱。流式细胞术分析表明，gD、gC和gB具有清晰的细胞表面表达，gH/gL的表面表达依赖于两者的共表达。假病毒颗粒分析证实，核心糖蛋白gD、gH、gL和gB可掺入VSV颗粒中。

（二）PaHV-2_pp系统的入侵效率差异

入侵实验表明，DHL_pp（缺乏gB）的入侵信号接近背景水平，而携带核心糖蛋白的DHLB_pp能显著增强入侵信号，表明gB为PaHV-2入侵所必需。缺乏gD的HLB_pp将入侵降至背景水平，证实gD也是入侵所必需的。三种表达系统比较显示，pDisplay系统产生的假病毒入侵信号最强（超过背景100-1000倍）。

（三）PaHV-2_pp对多种细胞系的高效入侵

研究人员测试了人类（293T、A549、SH-SY5Y、U373）、非洲绿猴（Vero76、Cos7）、恒河猴（MamuK8639-TERT）和小鼠（LR7）来源的细胞系。结果显示，所有细胞系均能被DHLB_pp和DHLBC_pp高效感染，但不同细胞系间入侵效率存在高达100倍的差异，其中SH-SY5Y和LR-7细胞的入侵效率最低。gC的加入对多数细胞系影响较小，但能显著增强SH-SY5Y和LR-7细胞的入侵效率。与报告病毒比较发现，PaHV-2_pp入侵效率与PaHV-2感染在不同细胞系间存在差异，提示非人灵长类细胞系可能在入侵后步骤对PaHV-2感染更具许可性。

（四）PaHV-2_pp适用于抗体介导的中和检测

研究人员使用两组狒狒血清评估了PaHV-2_pp的中和检测能力。第一组12份ELISA阳性血清的NT₅₀值范围（100至2424）与报告病毒测定结果相当，中位数分别为729.8和357，Pearson相关系数为0.6791。第二组涵盖血清转换过程的血清样本显示，假病毒和报告病毒系统均获得相似的中和效价谱，ELISA阴性血清NT₅₀范围为0.27至33.18，阳性样本范围为23.98至2308.00。通过Youden指数计算的平均截断值为51.29。年龄依赖性分析显示，所有动物在3-5岁血清转换期间均产生了中和抗体。

五、讨论与结论

该研究成功建立了基于VSV的PaHV-2假型系统，补充了现有的HSV-1和McHV-1假型系统。由于McHV-1研究需要高等级生物安全实验室，VSV假型系统可在较低生物安全等级实验室中研究病毒入侵和中和作用。pDisplay系统（Igκ信号肽-HA标签）在糖蛋白表达和假病毒入侵方面表现最优。所有核心糖蛋白均定位于质膜，这是有效掺入VSV颗粒的前提。假病毒颗粒中糖蛋白的检测受限于缺乏特异性抗血清，gD和gC的检测存在困难。细胞嗜性分析显示PaHV-2_pp具有广泛的细胞系嗜性，与单纯疱疹病毒的广谱嗜性一致。不同细胞系间入侵效率的差异可能反映受体表达的差异，nectin-1可能是PaHV-2的主要受体。gC的加入能增强特定细胞系的入侵效率，可能与其作为附着因子介导与细胞表面蛋白聚糖结合有关。中和实验表明，PaHV-2_pp中和检测结果具有良好可重复性，与报告病毒结果中等程度相关。研究存在以下局限性：仅使用细胞系，对原代靶细胞的入侵效率有待研究；部分糖蛋白的颗粒掺入未能明确证实；假病毒缺乏gK等糖蛋白；产生细胞类型可能影响病毒感染性。总之，携带疱疹病毒糖蛋白的VSV假病毒是研究疱疹病毒入侵和中和的新型工具，可补充近期建立的报告病毒系统，用于研究单纯疱疹病毒的细胞、器官和物种嗜性，并有助于开发新型诊断方法。