经典Notch2信号调控铁回收巨噬细胞的发育与维持及铁稳态

《Nature Communications》：Canonical Notch2 signaling regulates development and maintenance of iron-recycling macrophages and iron homeostasis

　　

红髓巨噬细胞（red pulp macrophages, RPM）和骨髓巨噬细胞（bone marrow macrophages, BMM）是参与铁稳态与红细胞生成的铁回收细胞。研究人员通过条件性删除策略，利用Cx3cr1Cre介导的靶向作用使小鼠Notch信号组分失活，证明经典Notch2信号调控RPM和BMM的发育。功能性Notch2或其核介质Rbpj的缺失损害RPM和BMM的发育，并导致脾脏和骨髓中的铁过载。在Notch2缺失的情况下，原型RPM基因表达下调，并伴有脾脏髓外造血和脾脏微结构改变。用抗Notch2阻断抗体处理小鼠可重现遗传模型中受损的红细胞吞噬细胞和新生髓外造血表型。此外，出生后早期移植骨髓和胎肝祖细胞以Notch2依赖性方式挽救RPM和BMM的缺陷，表明具有Notch能力的祖细胞有修复缺陷组织驻留巨噬细胞龛的潜力。因此，该研究表明经典Notch2信号是铁回收巨噬细胞发育、维持和功能所必需的。

论文解读：经典Notch2信号是铁回收巨噬细胞发育、维持与铁稳态的关键调控枢纽

铁代谢是维持哺乳动物生命活动的基础过程之一，机体每天通过吞噬衰老红细胞并回收其中的铁来满足大部分造血需求。这一过程主要由组织驻留巨噬细胞（tissue-resident macrophage, TRM）中的铁回收细胞群完成，包括脾脏红髓巨噬细胞（red pulp macrophages, RPM）、骨髓巨噬细胞（bone marrow macrophages, BMM）和肝脏Kupffer细胞（Kupffer cell, KC）。其中，RPM和BMM通过红细胞吞噬作用降解衰老或损伤的红细胞，释放的铁被重新利用以支持红细胞生成。尽管近年来对单核吞噬细胞系统的发育起源和异质性已有深入认识，但调控RPM和BMM发育与维持的关键分子机制仍不明确。已有研究发现集落刺激因子-1（CSF-1）、转录因子Spi-C、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）、血红素加氧酶1（HO-1）、BACH1和白细胞介素-33等参与铁回收巨噬细胞的发育与功能，但这些因子是否与Notch信号通路存在协同或上下游关系尚不清楚。Notch信号通路在单核吞噬细胞系统发育中具有重要调控作用，例如Notch2及其下游核介质RBPJ参与脾脏和肠道特定树突状细胞亚群的发育，DLL4-Notch-RBPJ信号可诱导肝脏单核细胞分化为Kupffer细胞。然而，Notch信号是否调控RPM和BMM的发育及铁稳态，此前未见报道。基于这一空白，研究人员利用条件性基因敲除小鼠、单细胞转录组测序、抗体阻断及过继转移等策略，系统探究了经典Notch2信号在铁回收巨噬细胞发育和铁稳态维持中的作用。

研究人员首先构建了Cx3cr1Cre介导的Notch2条件敲除小鼠（N2ΔCx3cr1）和Rbpj条件敲除小鼠（RbpjΔCx3cr1），通过流式细胞术、无监督t-SNE聚类分析和定量PCR证实Notch2在单核细胞和髓系祖细胞中被有效删除。结果显示，N2ΔCx3cr1小鼠从出生后第1天即表现出RPM数量减少，并持续至成年期，脾脏出现肿大；同时BMM数量也显著降低。RbpjΔCx3cr1小鼠呈现相似的表型，说明经典Notch2信号通过RBPJ介导调控RPM和BMM发育。值得注意的是，用抗Notch2阻断抗体处理成年野生型小鼠可重现RPM丢失的表型，表明Notch2不仅参与发育，还维持成熟RPM的存活。在转录层面，N2ΔCx3cr1小鼠残留的RPM中，Cd163、Hmox1、Slc40a1、Pparg和Spic等原型RPM基因表达下调，而脾脏中CD163阳性单核细胞亚群出现代偿性扩增。单细胞RNA测序进一步揭示了Notch2或Rbpj缺失后RPM和Ly6Clo/int单核细胞发生广泛的转录改变，血红素代谢相关基因在RPM中富集上调，而Ly6Clo/int单核细胞中炎症通路相关基因上调。铁代谢分析显示，N2ΔCx3cr1小鼠脾脏和骨髓出现明显铁沉积，而肝脏铁含量降低，表明铁回收功能受损。激光共聚焦显微镜观察发现，Notch2缺失破坏了脾脏红髓与白髓之间的CD169阳性边缘区结构，F4/80阳性RPM大量减少，CD169信号异常弥散至红髓区。进一步的细胞增殖和凋亡检测表明，Notch2缺失并不影响RPM的增殖或凋亡，提示其作用机制并非通过改变细胞死亡或增殖速率。

为探究Notch2调控RPM和BMM发育的细胞自主性，研究人员进行了过继转移实验。将CD45.1阳性全骨髓细胞或骨髓Ly6Chi单核细胞转移至N2ΔCx3cr1新生小鼠体内，8至14周后供体来源的细胞能够分化为RPM并恢复脾脏结构，但未能恢复BMM；而脾脏细胞转移无此效果。利用ROSA26-mT/mG报告系统标记Notch2缺失或正常的骨髓细胞进行转移，结果显示只有具有完整Notch2的供体细胞才能重建RPM和BMM，而Notch2缺失的供体细胞无法恢复这些巨噬细胞群体，证明RPM和BMM的发育需要细胞内在的Notch2信号。胎肝祖细胞转移实验也得到了类似结果。体外分化实验进一步证实，DLL1配体与血红素协同作用，通过Notch2上调Spic、Slc40a1和Nr1h3等RPM特征基因，说明DLL1-Notch2信号与血红素-BACH1通路协同驱动铁回收巨噬细胞分化。在生理功能方面，N2ΔCx3cr1小鼠脾脏中出现了持续的CD71阳性红系祖细胞聚集，即脾脏髓外红细胞生成增强。抗体阻断Notch2同样诱发髓外造血，而对照组无此现象。在苯肼诱导的溶血性贫血模型中，Notch2缺陷小鼠在早期对贫血的适应似乎更好，血红蛋白下降较缓，但后期脾脏微结构和BMM恢复存在缺陷，提示Notch2对于造血应激后的组织修复至关重要。

讨论部分指出，Notch2与Spi-C、PPAR-γ可能共享或重叠的信号网络调控RPM和BMM发育。Notch2缺失选择性影响RPM和BMM而不影响肝脏Kupffer细胞，提示这些细胞可能具有共同或相似的发育起源。虽然谱系追踪研究显示稳态下多数RPM和BMM在P5-P7时间点尚未完全形成，或这些细胞在该阶段不表达Ms4a3或Cx3cr1，但无论其具体起源如何，Notch2都是形成和维持正常RPM与BMM池的关键因子。此外，Notch2缺失导致的CD169阳性边缘区结构破坏与LXRα缺陷小鼠有部分相似，而Notch2在体外可调控Nr1h3表达，提示LXRα可能是Notch2的下游效应分子。研究还提出，脾脏中DLL1表达的内皮细胞或成纤维细胞可能通过Notch2信号调控RPM前体的分化。该研究也存在局限性：Cx3cr1Cre的广泛表达无法精确定位巨噬细胞祖细胞的具体起源，骨髓中其他巨噬细胞亚群也可能参与铁相关表型，且Notch2配体的具体细胞来源尚未直接鉴定。综上，研究人员得出结论：经典Notch2信号是RPM和BMM发育、维持和功能所必需的，该信号通过调控铁回收巨噬细胞影响铁稳态和红细胞生成，并维护脾脏微结构的完整性。这一发现为理解组织驻留巨噬细胞发育的调控网络提供了新视角，也为铁代谢紊乱相关疾病的治疗提供了潜在靶点。

论文发表于《Nature Communications》。