锥虫科寄生虫SL RNA反式剪接第二步的结构基础与机制

《Nature Communications》：Structural basis of step II spliced leader RNA trans-splicing in trypanosomatid parasites

　　

信使RNA（mRNA）合成是真核基因表达的基础。在动质体寄生虫中，包括人类病原体锥虫属（Trypanosoma）和利什曼属（Leishmania），mRNA通过称为剪接leader（SL）RNA反式剪接（trans-splicing）的机制产生。该过程中，来自小型非编码RNA的短SL外显子（exon）连接到每个mRNA的5′端，保障转录本稳定与翻译。尽管研究数十年，SL反式剪接的结构与机制基础仍不清楚。本研究报道了来自利什曼属蜥蜴种（Leishmania tarentolae）的第二步（step II）SL反式剪接机器的低温电子显微镜（cryogenic electron microscopy，cryo-EM）结构。这些结构揭示了SL外显子连接（exon ligation）的分子机制，并发现谱系特异性适应如何重塑锥虫科转剪接体（trans-spliceosome）以支持SL反式剪接，同时保留核心剪接体化学。结果建立了SL反式剪接的机制框架，并阐释了深层分化真核生物中RNA加工的系统发育多样化。

论文《Structural basis of step II spliced leader RNA trans-splicing in trypanosomatid parasites》发表于《Nature Communications》。研究背景方面，锥虫科（trypanosomatid）寄生虫如Trypanosoma brucei、Trypanosoma cruzi与Leishmania物种分别引起昏睡病、查加斯病和利什曼病，全球公共卫生负担重且药物选择有限。该类生物蛋白质编码基因以多顺反子（polycistronic）转录单元组成，缺乏个体启动子，基因表达主要在转录后水平调控；成熟mRNA依靠SL反式剪接与多聚腺苷酸化从长前体转录本中产生。SL反式剪接与常规顺式剪接（cis-splicing）进化相关，均经分支（branching）与SL外显子连接两次转酯反应，由转剪接体催化。现存问题是：锥虫科U丰富snRNA序列与结构高度分化，U2 snRNA缺分支点识别基序，U2/U4具退化Sm位点并由锥虫特异性Sm样（SSm）蛋白结合；SL RNA如何被U2、U5、U6 snRNA识别招募与稳定在催化核心尚不明；许多剪接因子与后鞭毛生物（opisthokont）同源物序列同一性仅10–30%，部分无同源物，仅靠质谱难以完整界定亚基组成；此前无结构信息，机制主要停留生化研究。

研究人员通过在L. tarentolae rDNA位点引入亲和标签CDC5L，从核提取液中纯化内源转剪接体，获得缺失U1/U4、富集Y分支前体mRNA的第二步复合体；结合质谱、AlphaFold2-multimer蛋白互作筛选与单颗粒cryo-EM，解析了trans-C*与trans-P两种第二步状态，整体分辨率2.7 ?与2.8 ?，建模4条snRNA、前体mRNA链及68个蛋白，总质量约3.2 MDa。

主要关键技术方法如下：以L. tarentolae为样本来源，采用亲和纯化内源转剪接中间体、质谱鉴定蛋白组成、AlphaFold2-multimer系统蛋白—蛋白互作（PPI）预测、单颗粒cryo-EM结构解析与聚焦分类精修、以及体外ATP酶连续偶联 assay 分析PRP22/DHX8与其截短体活性。

研究结果部分保留小标题说明。Capturing SL trans-splicing machineries from trypanosomatid parasites：研究人员用CDC5L标签纯化得到缺U1/U4、含U2/U5/U6/SL snRNA的复合体，质谱检出NTC-NTR、SLU7、PRP17、PRKRIP1、CACTIN、PRP22/DHX8与外显子连接复合体（EJC）成分，无Bact/第一步/解组装特征蛋白，证明样品富集第二步转剪接体，且第二步可能是限速阶段。Cryo-EM analysis of step II trypanosomatid trans-spliceosomes：获得trans-C（待SL外显子连接）与trans-P（连接后）两态；聚焦分类与AI互作网络辅助分配密度，实现snRNA、前体mRNA与68个蛋白高精度建模。Overall structure of step II trypanosomatid trans-spliceosomes：架构近似典型第二步顺式剪接体，保留U2/U5/U6催化核心与NTC-NTR支撑；特有SL snRNP兼作底物，EJC在trans-C结合SL外显子、trans-P消失；锥虫特有Sm16.5K、Sm15K、PRC3、PRC5、SDE2-like、RBP1及PRP18 NTE、CRNL1 CTE等扩展域重塑复合体。Mechanisms of trypanosomatid step II SL trans-splicing：U5 loop I对齐SL外显子5′剪接位（5′SS）与前体mRNA 3′剪接位（3′SS）；U6 ACAGA螺旋稳定SL outron；催化位点保守，3′SS G与SL outron 5′SS G40非Watson–Crick配对，3′SS A^?1与分支腺苷非经典配对；trans-C中SL外显子末位G39翻出，因无FAM32直系物而采样多构象，trans-P中G39插入并完成连接；分支点周边因U2缺乏保守基序而无稳定螺旋密度。Adaptations associated with SL trans-splicing：典型顺式剪接中稳定内含子的RBM22与AQR解旋酶缺失；SL snRNP的Sm环占据RBM22位置并稳定U6–SL outron螺旋；PPIL1 C端尾接合PRP19 WD40域，PRP17/SNW1重排接触，以新互作网补偿丢失的拟直核因子。Recognition of the SL exon by the Exon Junction Complex：trans-C有完整EJC（eIF4A3、MAGOH、RBM8A加Zn-knuckle因子），CWC21 CTE与Zn-knuckle以磷酸骨架/核糖/π堆积稳定SL外显子15–23位；PRP18 NTE连CWC22 NTD，将EJC结合与催化位感知偶联；eIF4A3结合ADP而非ATP，提示水解后闭合钳定，连接后EJC密度消失。Structural innovations of trypanosomatid spliceosomal proteins：U6 LSm环在激活后保留并对接SYF1/CRNL1 NTR支架，替代后鞭毛动物AQR位置；PRC3/PRC5经正电荷沟稳定U2/U6 helix II弯曲构象；U2 Sm环含Sm15K/Sm16.5K，Sm15K尾接RBP1替代人PPIE RRM；SDE2-like经泛素样加工成SDE2-C进入催化核心近U2/U6 helix I；LtaPh1601800占人FAM192A/酵母Fyv6位，空间保守暗示参与3′SS选择。Trypanosomatid-specific network of the DEAH-box helicase PRP22/DHX8：PRP22无核苷酸、RecA2开/合两构象，被CRNL1 CTE、CACTIN NTD、NKAP、SNW1锁于预激活态；L. tarentolae中PRP22^ΔNTD ATP周转K_cat=43.29±0.79 min^?1高于全长16.4±0.25 min^?1，NTD-linker抑制ATPase；LtaP16.0490具退化Walker A/B但K_cat=0.15±0.04 min^?1，为第二非典型ATP酶伴PRP22。

讨论部分总结：研究人员提出晚期SL反式剪接模型——trans-C*中CACTIN、SLU7、NKAP、PRKRIP1、PRP18定位稳定SL外显子与3′SS；trans-P中首组因子不稳，PRP18经NTE传信号致EJC脱落；PRP22持续停靠预激活无核苷酸态采样RNA；第二步因子全解离后CRNL1 CTE/CACTIN NTD/PRP22 NTD/NKAP锁释放，完全激活PRP22释出连接后SL-capped mRNA与次组因子，转剪接体进入解组装；DHX15如何接近仍被LSm环遮蔽的U6 3′端未明。锥虫科虽深部分化，仍保保守催化核心：U6 ACAGA螺旋稳SL outron，U5定位不变SL外显子，3′SS识别、金属离子配位与对位保守；但架构被谱系创新重排，缺失典型内含子稳定因子，以扩展域与新平台替代丢失RNA基序，形成抑制解旋酶、稳瞬中间体、传导连接信号的网络。EJC在锥虫非经典NMD标记，而在保守SL外显子上瞬时组装，连接后脱离，可能作为转剪接体装配与催化的检查点，不似后鞭毛动物持久标记。

研究结论部分翻译：研究人员呈现了锥虫科寄生虫SL反式剪接机器的结构快照，提供了其分化RNA与蛋白组分的近原子清单，揭示了第二步反应的分子基础，由此为数十年的生化研究建立了结构框架。晚期SL反式剪接的新模型凸显锥虫特异性蛋白适应如何协调第二步保守化学并有序释放mRNA。首先，trans-C*中SL外显子与3′SS被CACTIN、SLU7、NKAP、PRKRIP1与PRP18精确定位稳定以备第二次催化；其次，trans-P中首组第二步因子在连接后不稳并开始解离，PRP18经NTE将事件传给EJC，使EJC从SL外显子与转剪接体脱落；第三，第二步中PRP22以无核苷酸预激活态稳驻并采样前体mRNA；第四，第二步催化因子完全解离后，曾限制PRP22转位的CRNL1 CTE、CACTIN NTD、PRP22 NTD与NKAP之锁释放；最后，完全激活的PRP22释放连接后SL前体mRNA并带出第二组第二步因子，转剪接体待解组装，此后DHX15可能解U6 3′端Y结构，但LSm环未脱时如何接近底物仍不清。尽管与后鞭毛动物深部分化，锥虫科保留高度保守剪接体催化核心，保住3′SS识别、金属离子配位及SL RNA与前体mRNA精确对位；U6 ACAGA螺旋稳SL outron，U5 snRNA将不变SL外显子置于催化核心，第二步因子进一步固定3′SS。催化化学保守，但转剪接体架构被谱系创新广泛重塑：典型内含子稳定因子被锥虫特异组分替换，蛋白扩展域建新结合平台以稳RNA、补偿变异并替代丢失经典RNA基序，从而建立多层网络抑制解旋酶、稳瞬中间体、参与信号传导并确保释放前精确外显子连接。结构还显示完整EJC在保守SL外显子瞬时组装；锥虫几乎无内含子，EJC不似后鞭毛动物作NMD标记，而是连接前稳SL外显子、连接后脱离，或成转剪接体装配与催化的检查点，具体是否参与mRNP成熟仍待阐明。