《Scientific Reports》：Pharmacological preconditioning with cilostazol reverses steatosis and protects the liver against ischemia-reperfusion injury in steatotic rats
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代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD）可显著增加肝脏手术期间发生肝脏缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）损伤的易
代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD）可显著增加肝脏手术期间发生肝脏缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）损伤的易感性。研究人员探究了在果糖诱导的脂肪变性大鼠模型中，短期预先给予磷酸二酯酶-3（phosphodiesterase-3, PDE-3）抑制剂西洛他唑（cilostazol）是否能够保护脂肪变性肝脏。通过为期6周的高果糖饮食诱导Sprague–Dawley大鼠出现肝脏脂肪变性。在实施60分钟选择性肝叶缺血并随后进行2–24小时再灌注之前，研究人员通过口服灌胃给予动物西洛他唑（5 mg/kg/天）或溶媒，持续3天或7天。采用超声血流测量法和激光多普勒血流测量法评估肝动脉血流和微循环灌注；采用分光光度法测定血清转氨酶。利用组织学和免疫组织化学方法对脂肪变性、MPO阳性中性粒细胞浸润、细胞凋亡及肝细胞细胞周期相关活性进行定量分析。与对照组相比，西洛他唑预处理可减轻脂肪变性、改善肝动脉和微循环灌注、限制肝细胞凋亡，并增加肝细胞细胞周期相关活性。在再灌注2小时后，西洛他唑治疗组的中性粒细胞浸润高于对照组。然而，随后该指标下降，而对照组则持续升高，导致再灌注24小时后西洛他唑治疗组的中性粒细胞计数较低。总体而言，西洛他唑预处理通过减轻脂肪变性、改善灌注、限制凋亡和增强细胞周期相关活性，减轻了脂肪变性肝脏的温缺血再灌注损伤，支持在脂肪变性肝脏手术前进行进一步评估。
脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD）在肝脏手术中日益常见，与非脂肪变性肝脏患者相比，其缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）损伤易感性更高，发病率和死亡率也更高。脂肪变性肝脏的结构和代谢改变会损害窦状隙微循环、限制再生能力并放大炎症反应，使得短暂入肝血流阻断（如Pringle手法）在此类情况下尤其具有损伤性。随着MASLD中肝切除手术数量的增加，迫切需要开发能够保护脆弱肝组织免受I/R损伤并改善手术结局的药物策略。
研究人员前期已在果糖诱导的脂肪变性大鼠模型中证明，围手术期给予磷酸二酯酶-3（phosphodiesterase-3, PDE-3）抑制剂西洛他唑可逆转脂肪变性、减轻炎症并改善肝切除术后再生，凸显了其在脂肪变性肝脏手术围手术期应用的潜力。在此研究基础上，本工作旨在独立于肝切除和相应肝脏质量丢失，单独研究西洛他唑对温缺血再灌注损伤的影响。研究人员因此采用了果糖诱导脂肪变性大鼠的选择性肝叶入肝血流阻断对照模型，并在再灌注2小时和24小时评估了肝灌注、中性粒细胞浸润、细胞凋亡和细胞周期相关活性的早期与后期变化。研究假设短期西洛他唑药物预处理可提高脂肪变性肝组织对温缺血再灌注损伤的耐受性。
研究人员使用48只Sprague–Dawley大鼠（干预前体重231 ± 14 g；11只雌性，37只雄性，来源于德国萨尔大学实验与临床外科研究所），在恒温22°C、12小时/12小时光暗循环条件下饲养，自由摄食标准颗粒饲料和饮水。大鼠被随机分为西洛他唑组（n=32）和对照组（n=16），每组再分为若干亚组，每亚组8只。实验符合欧盟动物保护指令（2010/63/EU）及美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南，并获得当地主管部门批准（许可号15-2015），同时遵循ARRIVE指南。
所有大鼠均以高果糖饲料（high-FRC diet；66%果糖、11%脂肪、19%蛋白质）喂养6周以诱导脂肪变性。随后，西洛他唑组经口服灌胃给予西洛他唑5 mg/kg/天，连续3天（Cilo3d；n=16）或7天（Cilo7d；n=16），对照组给予等量水。每个治疗亚组再根据再灌注时间（2小时或24小时）分为每亚组8只。术后继续每日给予西洛他唑及高果糖饲料。手术采用异氟烷麻醉，腹腔注射曲马多镇痛，行正中开腹后以血管夹阻断左外侧叶和尾状叶入肝血流60分钟。再灌注2小时组保持腹腔开放；再灌注24小时组则双层连续缝合关腹，24小时后再次开腹。随后分离肝动脉和门静脉，采用超声血流探头（Transonic Systems）和激光多普勒血流仪（PeriFlux System 500）分别测量肝动脉血流、门静脉血流及肝实质微循环灌注。测量后自下腔静脉采血2 mL，放血处死动物并采集肝组织。
肝组织样本以4%甲醛固定、石蜡包埋，切取3 μm切片行苏木精-伊红染色，光镜下评估肝细胞脂肪变性（以胞质空泡化反映），在20个高倍视野（high-power fields, HPFs）中计算脂肪空泡面积百分比。免疫组织化学采用间接免疫过氧化物酶染色法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）和裂解的caspase-3，以定量细胞增殖和凋亡；采用抗髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）抗体检测MPO阳性中性粒细胞。阳性细胞计数在连续20个HPF中平均。血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）活性经分光光度法测定。
统计分析在RStudio中进行，结果以均值±标准误（SEM）表示。对同一动物双叶测量的结局（MPO、PCNA、裂解的caspase-3、激光多普勒血流）采用含随机截距的线性混合效应模型（linear mixed-effects model, LMM），固定效应包括处理组、再灌注时间、肝叶及其交互作用，以III型方差分析评估全局效应，事后比较基于估计边际均值，并采用Tukey或Bonferroni校正。对每只动物单次记录的结局（血清ALT/AST、动脉及门静脉血流、肝脂肪变性）采用线性模型（linear model, LM），模型假设经Shapiro–Wilk检验、Levene检验及Q-Q图验证均满足，双侧p<0.05视为统计学显著。
研究结果：六周高果糖喂养后各组体重无显著差异。对照组大鼠出现明显的大泡性脂肪变性（40.1%±3.4%），西洛他唑预处理显著降低脂肪变性程度（Cilo3d为16.9%±1.2%，Cilo7d为10.1%±1.2%，均p<0.001），且Cilo7d低于Cilo3d（p=0.048）。肝血流方面，西洛他唑预处理在多个时间点显著增加肝动脉血流，门静脉血流仅在Cilo7d组再灌注2小时时显著高于对照组（p=0.016）。激光多普勒显示缺血叶灌注低于非缺血叶，Cilo7d组缺血叶在再灌注2小时时灌注显著高于对照组（p=0.049）。血清转氨酶方面，对照组明显升高，西洛他唑组均值较低，但仅Cilo3d组再灌注2小时时ALT显著低于对照组（p=0.048），Cilo7d组ALT自2小时至24小时显著下降（p=0.049），AST未见显著差异。
免疫组织化学结果：MPO阳性中性粒细胞浸润方面，线性混合效应分析显示处理（p=0.038）和再灌注时间（p=0.029）有显著主效应，处理×时间（p<0.001）和处理×肝叶（p=0.006）交互作用显著。再灌注2小时时，西洛他唑组中性粒细胞浸润高于对照组（非缺血叶Cilo3d：+2.36个/HPF，p<0.001；缺血叶Cilo7d：+1.46个/HPF，p=0.002）；再灌注24小时时，Cilo3d组缺血叶中性粒细胞显著低于对照组（?1.36个/HPF，p=0.009）。对照组缺血叶中性粒细胞自2小时至24小时显著增加（+1.46个/HPF，p=0.011），而Cilo3d组双叶均显著下降。增殖方面，再灌注2小时时仅Cilo7d组PCNA阳性细胞显著高于对照组；再灌注24小时时，两个西洛他唑组PCNA阳性细胞均显著高于对照组，其中Cilo7d组增加最为显著（健康叶+14.45个/HPF，缺血叶+10.24个/HPF，均p<0.001）。时间对比显示所有组PCNA均自2小时至24小时增加，西洛他唑组增幅更大。凋亡方面，西洛他唑预处理在再灌注2小时和24小时均显著降低裂解的caspase-3阳性细胞数，且Cilo7d组较Cilo3d组更低（多数比较p<0.05）。对照组凋亡细胞自2小时至24小时显著减少，西洛他唑组无显著时间变化。
讨论部分指出，全球MASLD患病率上升与膳食果糖摄入激增相平行。果糖过量通过作为底物和激活转录调节因子（如碳水化合物反应元件结合蛋白ChREBP和固醇调节元件结合蛋白1c SREBP1c）强烈诱导肝脏脂质合成。本研究中西洛他唑短期预处理在无肝切除的单纯I/R模型中减轻了脂肪变性、改善肝灌注、限制凋亡并增加早期细胞周期相关活性，扩展了研究人员先前在肝切除模型中的发现。作为选择性PDE-3抑制剂，西洛他唑防止cAMP降解，可能影响PKA依赖的脂质代谢、氧化应激、炎症和细胞存活通路。脂肪变性的减轻可能在缺血前形成一种代谢预处理，降低肝脏脂质负荷并改善微循环条件，从而减轻线粒体应激、窦状隙淤滞和炎症易感性。血清转氨酶升高幅度有限可能因选择性肝叶缺血范围较小所致，组织学终点比全身酶学指标更敏感地反映了局部保护效应。西洛他唑改善肝动脉血流与其血管扩张和抗血小板特性一致，可能通过抑制血小板形态改变和聚集、减少脂肪变性相关窦状隙狭窄、增加一氧化氮合酶表达及抑制腺苷摄取等机制改善窦状隙通畅性。MPO阳性中性粒细胞的早期升高和后期下降提示西洛他唑改变了中性粒细胞募集的时间模式而非全面抑制；早期升高可能与脂质动员引起的短暂代谢预激活和微循环改善有关，后期下降则与减轻持续的中性粒细胞积聚和继发组织损伤相容。凋亡的显著减少表明西洛他唑减弱了早期和持续性的凋亡活性，以7天预处理效果最强。PCNA阳性细胞增加提示细胞周期相关活性增强，但PCNA并非增殖特异性标记，尚需Ki-67等标记确认。与前期肝切除研究一致，PDE-3抑制可能在不同再生刺激下增强肝细胞增殖准备状态。cAMP介导的PKA信号可能是这些效应的生物学联系，但本研究未直接评估下游中间介质，机制解释仍属推断性。
研究局限性包括：动物数量有限（遵循3R原则）；缺乏假手术对照组；雌性大鼠仅11只，不足以进行性别分层分析；高果糖饮食模型属于加速且代谢严重的饮食诱导脂肪变性，不能完全代表人类MASLD的复杂性；缺血范围仅限于约30%肝脏，观察期仅24小时，无法评估长期再生结局和生存率；未直接检测细胞内cAMP水平、PKA活性及下游信号分子；MPO免疫组化仅反映中性粒细胞存在而非活化状态；缺乏瘦素对照组，无法确定效应是否脂肪肝特异；PCNA可能表达于DNA修复过程，非增殖的确证证据。
结论：在本实验性脂肪性肝病模型中，西洛他唑预处理减轻了温缺血再灌注损伤，表现为脂肪变性减轻、肝灌注保留、凋亡受限、中性粒细胞浸润呈时间依赖性调节以及早期细胞周期相关活性增强。这些发现支持在脂肪变性肝脏择期肝切除前进一步评估西洛他唑作为药物预处理策略，并需在缺血范围更大、随访更长以及脂肪变性与非脂肪变性肝脏直接比较的临床相关模型中加以证实。
