纳米姜黄素递送系统重塑抗寄生虫机制：PCL/F68纳米粒以低剂量诱导猪带绦虫囊尾蚴核仁损伤与死亡

《Antioxidants》：Nanoencapsulation Transforms Curcumin’s Antiparasitic Activity: Reduced Dose and Altered Mechanism in Taenia crassiceps Cysticerci

　　

摘要：游离姜黄素（free curcumin）已被证实对猪带绦虫（Taenia crassiceps）囊尾蚴具有致死作用，其机制在于干扰寄生虫的氧化还原代谢。然而，游离姜黄素高度不稳定，这限制了其生物利用度并削弱了其作为抗蠕虫药物的疗效。为克服上述限制，研究人员评估了聚己内酯-Pluronic?-F68纳米粒（PCL/F68 NPs）在体外给药中提高姜黄素稳定性以对抗囊尾蚴的效果。结果表明，PCL/F68 NPs能够在含水介质中有效保护姜黄素，在与10 μM载药纳米粒孵育120 h后，囊尾蚴死亡率达100%。与游离姜黄素（其杀囊尾蚴活性与活性氧（ROS）产生增加、寄生虫硫氧还蛋白抗氧化系统破坏以及皮层损伤相关）相比，载姜黄素纳米粒在无上述效应的情况下诱导囊尾蚴死亡，而与之相关的是显著的核仁结构改变，提示核仁功能障碍可能是寄生虫死亡的中介因素。降低的给药剂量、提高的生物利用度以及增强的抗寄生虫效力表明，PCL/F68-CUR NPs为囊尾蚴病的治疗提供了一种有前景的治疗策略。

纳米姜黄素递送系统重塑抗寄生虫机制：PCL/F68纳米粒以低剂量诱导囊尾蚴核仁损伤与死亡——基于《Nanoencapsulation Transforms Curcumin's Antiparasitic Activity》的论文解读

一、研究背景与问题

囊尾蚴病是由猪带绦虫（Taenia solium）幼虫引起的寄生虫病，被世界卫生组织列为被忽视的热带病，严重影响拉丁美洲、中南非洲及东南亚地区人群健康。当该寄生虫侵入神经系统引发神经囊尾蚴病时，可导致严重癫痫。由于该病带来巨大的健康和社会经济负担，寻找新型、可负担的抗寄生虫药物迫在眉睫。

姜黄素（curcumin）是从姜黄（Curcuma longa）根茎中提取的姜黄素类化合物，具有多靶点生物活性。在抗寄生虫领域，姜黄素因其干扰寄生虫关键生理过程的能力而受到关注。在绦虫中，硫氧还蛋白抗氧化系统是极具吸引力的药物靶点，因为绦虫的硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（thioredoxin glutathione reductase，TGR）与宿主的硫氧还蛋白还原酶（TrxR）结构不同。研究人员前期已证实金诺芬和姜黄素均能抑制绦虫TGR活性。游离姜黄素对猪带绦虫囊尾蚴具有剂量和时间依赖性的致死作用，其机制部分归因于TGR抑制，进而促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累，最终因氧化应激导致寄生虫死亡。

然而，姜黄素存在严重的药理学局限：水溶性极低、生理pH下化学稳定性差、通过自氧化快速降解、因快速代谢和清除导致生物利用度有限。其不稳定的主要原因是水相环境中易发生快速自氧化，生成反应性中间产物，降低有效浓度并影响生物反应的可重复性。这些限制使得游离姜黄素的直接药物给药面临挑战，尤其是在需要持续暴露的系统中。

因此，需要能够保护姜黄素分子、改善其在生物介质中的分散性并调节其释放特性的递送策略。纳米制剂递送系统应运而生。研究人员此前开发的聚己内酯/Pluronic? F68纳米粒（PCL/F68 NPs）已被证明适用于姜黄素的增溶和保护，且对神经元和胶质细胞具有良好的生物相容性。然而，尽管已有多种姜黄素纳米制剂报道，关于包封是否改变姜黄素对寄生蠕虫的作用机制，目前知之甚少。

本研究旨在评估一种旨在稳定姜黄素、便于其向囊尾蚴药物给药的纳米制剂的效果。研究人员使用猪带绦虫（Taenia crassiceps）作为研究模型，该虫种为非感染性绦虫，可规避直接操作猪带绦虫的挑战。猪带绦虫在小鼠腹腔内接种后可通过出芽进行无性繁殖，确保持续供应幼虫期囊尾蚴。

二、主要技术方法

本研究使用了以下关键技术方法：采用乳液法制备PCL/F68纳米粒并负载姜黄素（NP-CUR）或不含姜黄素（空NP）；利用动态光散射Zetasizer Nano ZS90测定粒径、多分散指数（PDI）和zeta电位；透射电子显微镜（TEM）评估纳米粒形态；分光光度法（426 nm）定量纳米粒中姜黄素含量；台盼蓝活体染色和温度诱导运动性评估囊尾蚴活力；基于NADPH依赖性GSSG还原的酶活性测定法检测TGR活性；CM-H₂DCFDA荧光探针定量整体囊尾蚴ROS；共聚焦荧光显微镜观察NP-CUR在囊尾蚴中的定位；透射电镜分析囊尾蚴超微结构及核仁完整性；灰度强度分析量化核仁结构差异。动物来源为10只8周龄雌性BALB/c小鼠腹腔接种猪带绦虫HYG株囊尾蚴，3个月后处死回收囊尾蚴。

三、研究结果

3.1 PCL/F68-CUR NPs的表征

通过乳液法制备的纳米粒，载姜黄素纳米粒（NP-CUR）呈球形，粒径为180.1 ± 19.8 nm，多分散指数为0.068 ± 0.02，表明粒子群体高度均一。zeta电位为?17.05 ± 0.07 mV，表明纳米制剂高度稳定，随时间聚集倾向低。空NP粒径较大（224.53 ± 1.91 nm）。空NP呈白色，而NP-CUR呈强烈黄色，表明姜黄素在纳米粒内保持未氧化状态。在囊尾蚴样本中，暴露1 h和120 h后均可通过姜黄素自身荧光检测到NP-CUR，表明其进入囊尾蚴且被纳米粒保护免受氧化至少5天。

3.2 NP-CUR对猪带绦虫囊尾蚴具有剂量和时间依赖性致死作用

未处理对照组和空NP孵育组囊尾蚴在120 h内均保持活力。相比之下，所有NP-CUR处理组在48 h后活力随时间下降。在120 h时，10 μM姜黄素存在下观察到囊尾蚴100%致死率。据此计算，NP-CUR对囊尾蚴的中位致死剂量（LD₅₀）为1.4 μM。

3.3 NP-CUR不一致地抑制囊尾蚴TGR活性

在24 h和48 h，无任何NP条件显著改变还原酶活性。72 h时仅在5 μM与10 μM NP-CUR处理组间发现TGR活性显著差异。96 h时空NP处理组相对对照组活性显著下降。120 h时对照组与NP-CUR处理组间无差异。由于缺乏一致的浓度或时间依赖性TGR活性降低，这些孤立的显著变化不表明NP-CUR对TGR有主要或一致的抑制作用。这一模式与游离姜黄素研究中TGR活性随浓度增加而持续下降的情况形成对比。

3.4 处理囊尾蚴中ROS的定量

24 h和48 h时，空NP和NP-CUR处理组ROS产生较对照组有轻微但不显著的增加。72 h时，5 μM和10 μM NP-CUR处理组较空NP组ROS显著增加。96 h时空NP和5 μM NP-CUR处理组较对照组ROS显著下降。120 h时对照组与NP-CUR处理组间无差异。总体而言，NP-CUR处理未产生一致的或浓度依赖性的ROS增加。早期（24 h）所有处理组（包括空NP）的ROS增加提示纳米粒暴露本身可能对初始ROS反应有贡献。缺乏持续或剂量依赖性的ROS增加与游离姜黄素处理后的反应形成对比。

3.5 NP-CUR干扰囊尾蚴核仁完整性

透射电镜观察显示，NP-CUR处理未对囊尾蚴皮层结构造成明显损伤，与游离姜黄素产生的皮层和实质细胞损伤不同。值得注意的是，NP-CUR处理组在核水平发现了超微结构差异，具体表现在核仁。核仁体可观察到完整、缺失或碎片化三种状态。虽然这三种状态在空NP处理组和未处理对照组中均存在，但NP-CUR处理显著增加了核仁碎片化和缺失的频率（p = 0.002）。对照组与空NP组间无显著差异（p = 0.366），表明核仁结构效应与姜黄素处理相关而非纳米粒递送方式所致。灰度强度分析显示NP-CUR处理组与未处理对照组的核内强度分布显著不同，而对照组与空NP组间无显著差异。相比之下，游离姜黄素处理（即使250 μM）不引起核仁结构改变，核仁保持完整。

四、讨论与结论

讨论部分指出，纳米制剂使姜黄素能够在体外条件下以远低于游离姜黄素所需浓度发挥抗寄生虫作用。NP-CUR在1 h即可与囊尾蚴皮层结合并持续至120 h，姜黄素以纳米粒形式进入囊尾蚴并稳定结合于皮层内，随后随时间释放进入胞质。NP-CUR处理未观察到皮层超微结构损伤，研究人员推测游离姜黄素在接触培养基时立即开始自氧化，使囊尾蚴暴露于大量ROS，这可能是皮层损伤的原因；而纳米粒保护姜黄素不暴露于水相介质，因此不在介质中产生ROS。

游离姜黄素实现完全致死需500 μM浓度，是NP-CUR所需浓度（10 μM）的50倍。NP-CUR处理伴随的ROS增加仅为约20%，而游离姜黄素处理导致约100%的ROS大幅增加。TGR活性未被NP-CUR抑制。核仁成像分析提供了NP-CUR处理后囊尾蚴细胞死亡的另一种可能机制，可能独立于寄生虫细胞氧化还原活性。核仁除参与核糖体生物发生外，还参与基因组组织、表观遗传调控以及作为细胞应激反应的传感器和协调者。姜黄素已被报道影响多个生物系统中的染色质组织和表观遗传调控。在克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）模型中，姜黄素（5和10 μM）产生核仁解组织，与本研究观察到的改变相似。NP-CUR处理囊尾蚴中观察到的核仁碎片化提示姜黄素可能破坏核仁功能，这一过程已知可激活凋亡信号通路。但DNA片段化分析和细胞色素c释放检测均未提供NP-CUR处理囊尾蚴中凋亡通路激活的证据。研究人员认为核仁是公认的细胞应激传感器，其结构和功能可被多种应激源改变。NP-CUR处理可能扰乱核仁稳态，这种扰动可导致细胞应激，若无法解决最终导致细胞死亡。

结论部分总结：暴露于10 μM NP-CUR 120 h导致囊尾蚴100%死亡率，表明NP-CUR能以远低于游离姜黄素的浓度实现完全抗寄生虫活性。姜黄素在游离形式和纳米粒形式中均保留抗寄生虫活性，但实现完全死亡所需浓度和相关的细胞反应在两种制剂间不同。NP-CUR处理与一致的ROS增加或TGR活性抑制无关，但观察到核仁形态改变。这些发现表明纳米制剂可能改变姜黄素的生物反应，尽管NP-CUR诱导毒性的具体机制仍有待确定。这一区别应在未来评估纳米粒姜黄素制剂作为潜在抗寄生虫疗法的研究中予以考虑。