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转座因子（transposable elements, TEs）在宿主基因组中含量丰富，但通常被认为局限于其表达所在的细胞内，内源性逆转录病毒（endogenous retroviruses, ERVs）是显著例外。本研究中，研究人员鉴定了一组长末端重复（lo
转座因子（transposable elements, TEs）在宿主基因组中含量丰富，但通常被认为局限于其表达所在的细胞内，内源性逆转录病毒（endogenous retroviruses, ERVs）是显著例外。本研究中，研究人员鉴定了一组长末端重复（long terminal repeat, LTR）逆转录转座子，尽管缺乏逆转录病毒入侵通常所需的融合性包膜蛋白（Envelope protein），它们仍能从果蝇（Drosophila）卵巢内的体细胞感染生殖系。相反，这些元件编码一个短的跨膜蛋白sORF2，其结构特征与病毒细胞间融合蛋白（cell-cell fusogens）相似。通过遗传学、成像和电子显微镜技术，研究人员证明sORF2定位于含有逆转录病毒衣壳的侵袭性体细胞突起中，并与卵母细胞膜建立物理接触。在缺乏sORF2时，突起形成以及衣壳从体细胞到生殖系的传播均被消除。值得注意的是，sORF2样蛋白在昆虫逆转录转座子中广泛存在，也出现于鱼类无包膜病毒（nackednaviruses）和禽类小RNA病毒（picornaviruses）中。这些发现揭示了一种非经典的、不依赖包膜的传播机制，为逆转录转座子与非包膜病毒所共有。
本论文发表于《Cell》。转座元件（TEs）通常被认为仅局限于其表达细胞内部，但内源性逆转录病毒（ERVs）是例外，它们可能通过过去的生殖系感染整合进宿主基因组。果蝇基因组含有丰富且活跃的ERVs，是研究其生殖系生物学的理想模型。果蝇ERVs与脊椎动物ERVs共享gag、pol、env基因及两侧LTR的典型结构。已有研究表明，含env的Gypsy类逆转录转座子可在卵巢体细胞表达并以病毒颗粒感染卵母细胞；而缺乏env的LTR逆转录转座子通常被认为仅在生殖系表达。然而，MDG1组无env逆转录转座子在体细胞中被piRNA通路抑制，提示它们可能具有未知的感染策略。研究人员因此系统分析果蝇卵巢中LTR逆转录转座子的表达与传播能力，旨在揭示不依赖Env的细胞间传播机制。
研究人员通过体细胞piRNA通路敲低和RNA-seq发现，MDG1组6个亚家族在卵巢体细胞中显著去抑制，并在flamenco位点富集。单分子荧光原位杂交（smFISH）和免疫荧光（IF）显示412、Stalker2和Mdg1的RNA及Gag衣壳蛋白可从滤泡细胞进入卵母细胞。通过CRISPR编辑flamenco位点删除内源412-Stalker2（flamΔ412-St2），证明这些元件可自主感染。研究人员鉴定并表征了MDG1特有的小开放阅读框sORF2，其编码的跨膜蛋白具有FAST细胞融合蛋白特征。电镜观察发现sORF2与病毒样颗粒（VLPs）定位于滤泡细胞顶端膜形成的侵袭性突起中，并与卵母细胞膜形成紧密并列的融合突触。通过将异源转座子StalkerX和Mack导入果蝇并突变sORF2，证实sORF2是突起形成和衣壳转入卵母细胞所必需的。生信分析发现sORF2/FAST样蛋白广泛存在于昆虫LTR逆转录转座子中，并存在于鱼类无包膜病毒和鸟类小RNA病毒中；细胞融合试验证实禽类小RNA病毒ORF2蛋白具有融合活性。该研究揭示了一种非经典的、不依赖包膜的逆转录转座子直接细胞间传播机制。
关键的技术方法包括：利用CRISPR/Cas9编辑flamenco位点生成flamΔ412-St2等位基因，以及将外源逆转录转座子作为单拷贝转基因导入果蝇并构建sORF2移码/缺失突变；采用poly(A) RNA-seq、small RNA-seq和长读长直接RNA-seq分析转录组，结合非靶向质谱鉴定sORF蛋白翻译产物；使用smFISH和免疫荧光（IF）对RNA和蛋白进行细胞定位；通过透射电镜（TEM）、冷冻免疫电镜和电子断层扫描观察VLP与膜结构；运用AlphaFold3结构预测和多序列比对分析蛋白质特征；利用双分裂蛋白（DSP）细胞融合实验检测候选融合蛋白的合胞体形成活性。
**研究结果**：
**1. MDG1逆转录转座子获得病毒特性入侵生殖系**：通过体细胞piRNA通路敲低后的RNA-seq发现，MDG1组6个无env亚家族均被去抑制，且该组插入在flamenco位点显著富集。LTR-lacZ报告基因显示MDG1元件仅在滤泡细胞表达；smFISH检测到412、Stalker2和Mdg1 RNA在滤泡细胞顶膜聚集并进入卵母细胞，表明它们具有体细胞到生殖系的传播潜力。
**2. 412和Stalker2表现出自主感染性**：通过CRISPR删除flamenco中的412-Stalker2座位，生成仅激活MDG1元件而保留Gypsy组env元件受抑制的遗传背景。small RNA-seq和RNA-seq确认仅412和Stalker2被去抑制；smFISH和Gag免疫荧光在卵母细胞中检测到这两种元件的RNA和衣壳蛋白，证明它们不依赖其他env逆转录病毒而自主感染卵母细胞。
**3. MDG1逆转录转座子表达两个辅助sORF**：长读长RNA-seq检测到包含sORF1和sORF2的全长转录本，也检测到仅含sORF1的短转录本。AlphaFold3结构预测表明sORF1具有螺旋-转角-螺旋基序，sORF2形成中央疏水α螺旋。质谱分析确认sORF1和sORF2蛋白确实被翻译。免疫荧光显示sORF1局限于滤泡细胞核，而sORF2定位于质膜并与Gag衣壳共定位。
**4. sORF2是具有细胞间融合蛋白特征的跨膜蛋白**：多序列比对显示所有MDG1组sORF2蛋白均含跨膜结构域、胞外两亲性基序、胞质侧多聚碱性区域及两亲性基序，部分还含有N端豆蔻酰化基序，这些特征组合与呼肠孤病毒FAST蛋白高度相似。
**5. 412 sORF2和衣壳定位于滤泡细胞突起与卵母细胞膜之间的融合突触**：透射电镜和免疫电镜显示，VLPs和sORF2在滤泡细胞顶膜聚集；随后形成富含VLPs的侵袭性突起伸入卵母细胞。电子断层扫描显示体细胞与卵母细胞膜在突起处紧密并列甚至难以区分，提示存在局部膜融合位点，即“融合突触”。突起形成具有特定发育窗口。
**6. sORF2是逆转录转座子体细胞-生殖系传播所必需**：将从D. littoralis和D. saltans来源的StalkerX和Mack转座子导入果蝇后，smFISH检测到其RNA进入卵母细胞和滋养细胞；引入sORF2移码或缺失突变后，RNA和衣壳蛋白不再进入生殖系，电镜观察也完全缺失侵袭性突起，VLPs分散在体细胞胞质中。这表明sORF2对于VLP在顶膜聚集和突起形成必不可少。
**7. 编码sORF2的LTR逆转录转座子在昆虫基因组中广泛存在**：基于Repbase中约8500条节肢动物Metaviridae共识序列的计算筛选，鉴定出105个高置信sORF2/FAST样序列，分布于双翅目、鳞翅目和鞘翅目等29种昆虫。对D. melanogaster、埃及伊蚊和米象三种高质量昆虫基因组的全基因组扫描分别发现88、306和43个sORF2/FAST样序列，表明该策略在昆虫中非常普遍。
**8. sORF2/FAST样蛋白提示肝DNA病毒和小RNA病毒存在不依赖包膜的传播策略**：利用sORF2序列构建的HMM模型搜索病毒数据库，在鱼类无包膜病毒（nackednaviruses）和鸟类小RNA病毒（picornaviruses）中发现sORF2/FAST样蛋白。DSP细胞融合实验证明禽类poecivirus A1 ORF2和火鸡megrivirus A ORF2均能诱导GFP阳性多核合胞体形成，说明这些蛋白确实具有细胞间融合功能。
**讨论总结与研究结论**：讨论部分指出，MDG1逆转录转座子展示了不依赖包蛋白的病毒样感染性，直接细胞间传播可避免细胞外限制因子并绕过受体介导的内化。sORF2介导的融合似乎是受限且特异的，与发育性细胞融合蛋白更为相似，可能有利于在传播与宿主生育力之间取得平衡。该研究将FAST样蛋白的分布从呼肠孤病毒扩展到逆转录病毒、肝DNA病毒和小RNA病毒，显著拓展了fusogen家族。研究局限在于未能在简单异源细胞系统中重建MDG1 sORF2融合活性，也尚未明确sORF2与衣壳的直接相互作用机制。研究最终结论是：这些发现揭示了一种由逆转录转座子和非包膜病毒共有的非经典、不依赖包膜的传播机制。
