《Microplastics》：Short-Term Cellular Responses to Sub-100 nm PMMA and Polystyrene-Based Copolymer Nanoplastics in Human Embryonic Lung Fibroblasts: Cytotoxicity and Redox-Associated Markers
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摘要：空气传播的塑料颗粒是人类吸入暴露的一种潜在途径。本研究比较了人胚肺成纤维细胞对四种亚100纳米纳米塑料制剂的短期响应：交联PMMA颗粒（PMMA-70、PMMA-90）和苯乙烯/对苯乙烯磺酸钠/甲基丙烯酸共聚物（PS-65、PS-80）。细胞分别暴露1、
摘要：空气传播的塑料颗粒是人类吸入暴露的一种潜在途径。本研究比较了人胚肺成纤维细胞对四种亚100纳米纳米塑料制剂的短期响应：交联PMMA颗粒（PMMA-70、PMMA-90）和苯乙烯/对苯乙烯磺酸钠/甲基丙烯酸共聚物（PS-65、PS-80）。细胞分别暴露1、3或24小时，评估了代谢活性（MTT）、线粒体膜电位、细胞内氧化剂相关荧光（DCF）、DNA损伤反应标志物（8-oxo-dG、γH2AX、BRCA1）以及蛋白质相关信号（NOX4、NRF2、NF-κB、STAT3、PCNA、BAX/BCL2、LC3、Beclin-1）。在等质量浓度-响应实验中，PMMA-70在远低于其他制剂的标称浓度下即降低了MTT信号，而PMMA-90表现出最低的表观细胞毒性。分子终点在28 μg/mL（PS-65、PS-80、PMMA-90）和0.08 μg/mL（PMMA-70，因其较高细胞毒性）条件下测量；所得图谱具有制剂特异性，不构成剂量匹配的比较。DCF相关荧光无显著变化，而NOX4、NRF2、γH2AX和BRCA1相关信号显示出制剂和时间依赖性变化。在所测试条件下，各制剂通常与较低的总细胞内NF-κB相关荧光相关，其中PS-65和PMMA-90在24小时后下降最为显著（分别降至对照信号的约40%和20%）。在完全培养基中，PMMA基制剂形成180–200 nm的水动力学分散体，而PS基制剂为81–90 nm，表明标称初级粒径并不能描述暴露相关的颗粒状态。这些描述性图谱值得后续采用匹配剂量、功能性细胞终点和生理学相关暴露模型进行追踪研究。
研究背景与科学问题
塑料制品的大规模使用及其有限的生物降解性已成为日益严重的环境问题。在微生物、紫外线辐射和机械磨损作用下，塑料碎片会转化为微塑料（直径100 nm–5 mm）和纳米塑料（NPs，直径小于100 nm）。纳米塑料可通过食物链进入人体，也可通过吸入污染空气进入人体呼吸道，直接接触呼吸道上皮表面，穿透肺组织，引起呼吸道刺激、炎症、间质纤维化等病变。现有研究表明，纳米塑料的毒性机制涉及氧化应激、炎症、免疫功能障碍、神经毒性及代谢紊乱等，其中氧化应激被认为是介导细胞反应的核心环节。
尽管聚苯乙烯（PS）纳米塑料在体内外模型中已被广泛研究，尤其是其通过氧化应激诱导肝毒性、铁死亡等效应，但对于化学性质不同的共聚物（如含对苯乙烯磺酸钠和甲基丙烯酸的共聚物）以及聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）纳米塑料在人类肺成纤维细胞中的直接比较研究仍极为匮乏。特别是，吸入是人体暴露于空气传播塑料颗粒的合理途径，而纳米颗粒在肺细胞中长期积累可能引发慢性炎症和尘肺病，这一领域几乎未被探索。因此，开展本项研究旨在填补这一空白。
研究设计与主要发现
研究人员合成了两种系列的纳米颗粒：一是基于苯乙烯（St）、对苯乙烯磺酸钠（NaStS）和甲基丙烯酸（MAA）的共聚物颗粒（PS-65和PS-80）；二是基于甲基丙烯酸甲酯（MMA）并引入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）的PMMA颗粒（PMMA-70和PMMA-90）。研究人员将人胚肺成纤维细胞暴露于这些纳米塑料1、3和24小时，系统评估了细胞代谢活性（MTT法）、线粒体膜电位（TMRM探针）、细胞内活性氧水平（DCF荧光）、DNA损伤反应标志物（8-oxo-dG、γH2AX、BRCA1）以及一系列蛋白质相关信号（包括NOX4、NRF2、NF-κB、STAT3、PCNA、BAX/BCL2、LC3、Beclin-1）。
主要发现包括：（1）四种纳米塑料制剂表现出截然不同的MTT代谢活性曲线，其中PMMA-70在极低标称浓度（0.08 μg/mL）下即显著降低MTT信号，而PMMA-90在测试浓度范围内表观细胞毒性最低；（2）在完全培养基中，PMMA基制剂的水动力学直径增至180–200 nm，而PS基制剂仅为81–90 nm，表明标称初级粒径不能代表实际暴露状态下颗粒的特征；（3）DCF相关荧光无统计学显著变化，但NOX4、NRF2、γH2AX和BRCA1相关信号呈现制剂和时间依赖性改变；（4）所有制剂均与总细胞内NF-κB相关荧光降低有关，其中PS-65和PMMA-90在24小时后降幅最大（分别降至对照信号的约40%和20%）；（5）STAT3相关荧光在暴露1小时后短暂升高，BAX/BCL2比值在早期时间点升高，提示促凋亡分子谱的倾向。
关键技术方法
- 1.
乳液共聚合技术：用于合成粒径60–90 nm的纳米塑料颗粒，并通过旋转蒸发和透析纯化去除未反应单体和可溶性杂质。2. 动态光散射（DLS）和微电泳法：测定纳米颗粒在纯水和完全培养基中的水动力学直径、多分散指数（PDI）和zeta电位，以表征其物理化学性质和蛋白冠形成后的状态。3. 透射电子显微镜（TEM）：观察干燥状态下颗粒的形状和尺寸分布，并进行半定量图像分析获得等效直径。4. 衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）：确认聚合物结构中官能团的成功引入。5. 流式细胞术：用于检测线粒体膜电位（TMRM）、细胞内活性氧水平（DCF）以及多种蛋白质相关荧光信号（使用特异性抗体标记）。6. MTT比色法：评估细胞代谢活性和筛选暴露浓度。7. 线性混合效应模型：用于统计分析，以生物学重复为随机效应，控制多重比较。
研究结果
3.1 合成与理化表征
通过乳液共聚合成功制备了两类纳米颗粒。TEM分析显示，PS-65、PS-80、PMMA-70和PMMA-90的平均等效直径分别为47.7±4.3 nm、55.7±3.4 nm、62.3±5.7 nm和87.0±7.2 nm，粒径分布较窄。在完全培养基中，PS基制剂的水动力学直径仅小幅增加至81–90 nm，而PMMA基制剂则显著增大至180–200 nm，表明其与血清成分发生更强的相互作用或形成更大的聚集态。zeta电位绝对值在培养基中普遍降低，符合离子屏蔽和蛋白吸附特征。
3.2 细胞活力与浓度选择
MTT实验显示，PMMA-70在极低浓度下即可大幅降低细胞代谢活性，而PMMA-90在整个测试浓度范围内毒性最低。基于此，后续主实验中选择PS-65、PS-80和PMMA-90在28 μg/mL下进行，而PMMA-70则在0.08 μg/mL下进行，以避免严重细胞毒性对分子终点测量的干扰。
3.3 线粒体膜电位
除PMMA-70在1小时时引起TMRM荧光短暂升高约30%外，其余制剂在各时间点均未引起线粒体膜电位的统计学显著变化。
3.4 细胞内活性氧
所有纳米塑料制剂均未导致DCF相关荧光的统计学显著变化。
3.5 DNA损伤
PS-65在3小时时引起8-oxo-dG相关荧光轻度升高。PMMA-70在24小时时引起γH2AX相关荧光升高约30%，同时伴有BRCA1相关荧光轻度升高。PMMA-90则与8-oxo-dG和γH2AX荧光降低以及BRCA1荧光升高相关。
3.6 活性氧依赖的信号通路
PS-65在3小时时NOX4荧光降低，24小时时NRF2荧光升高。PS-80在24小时时NOX4荧光升高。PMMA-70在24小时时NOX4和NRF2荧光均升高。PMMA-90则与NRF2荧光降低相关。所有制剂均与总细胞内NF-κB相关荧光降低有关，PS-65和PMMA-90在24小时后分别降至对照的约40%和20%。
3.7 增殖与凋亡相关蛋白
所有制剂在1小时时均引起STAT3相关荧光升高。PCNA相关荧光无显著变化。BAX/BCL2比值在早期时间点（1小时）普遍升高，PS-80在24小时时仍保持升高。
3.8 LC3和Beclin-1相关荧光
PMMA-70在1小时时引起LC3荧光升高。Beclin-1荧光在特定制剂和时间点出现升高。
讨论总结与结论翻译
讨论总结：本研究发现，四种纳米塑料制剂在人胚肺成纤维细胞中引发了制剂特异性和时间依赖性的细胞响应。PMMA-70在极低浓度下即表现出最强的MTT信号抑制，而PMMA-90毒性最低。值得注意的是，所有制剂均与总细胞内NF-κB相关荧光降低有关，这与部分文献中报道的NF-κB激活方向相反，可能反映了不同纳米材料对信号通路的差异性调控。此外，PMMA-90在24小时时伴随8-oxo-dG和γH2AX荧光降低、BRCA1荧光升高，以及NRF2和NF-κB荧光降低，呈现出一种独特的分子谱。这些现象可能与BRCA1受NRF2和NF-κB调控的已知机制有关，但本研究的标志物水平变化尚不能确立因果信号通路关系。研究局限性包括：使用胚胎成纤维细胞而非成人原代肺成纤维细胞；采用浸没式液态培养而非更生理的气液界面模型；缺乏细胞摄取定量、正交验证实验（如Western blot、RT-qPCR）以及阳性对照；仅三个生物学重复限制了统计效力。因此，这些发现应视为探索性和假设生成性的。
研究结论翻译：这项探索性体外研究表征了人胚肺成纤维细胞暴露于两种PMMA基和两种聚苯乙烯基共聚物纳米塑料制剂后的短期细胞响应谱。各制剂显示出不同的MTT代谢活性谱：PMMA-70在测试浓度范围内与最大的MTT信号降低相关，而PMMA-90表观细胞毒性最低。在暴露相关的完全培养基条件下，PMMA基制剂形成了比PS基制剂更大的水动力学分散体（约180–200 nm vs. 约81–90 nm），表明标称的亚100 nm初级粒径类别并不能完全描述细胞所遇到的颗粒状态。所测得的线粒体膜电位、DNA损伤反应和蛋白质相关荧光信号呈现出制剂和时间依赖性模式。特别是，各制剂在NOX4、NRF2、STAT3、BAX/BCL2、LC3和Beclin-1相关荧光谱上存在差异，而较低的总细胞内NF-κB相关荧光是所有测试条件下最一致的模式，在PS-65和PMMA-90暴露24小时后最为显著。这些观察结果为单个纳米塑料制剂的早期细胞标志物响应提供了描述性图谱。由于PMMA-70在0.08 μg/mL下测试，而PS-65、PS-80和PMMA-90在28 μg/mL下测试，且各制剂在聚合物组成、交联度、表面相关性质和培养基中水动力学行为上也存在差异，因此观察到的谱图不允许进行剂量匹配或制剂间效应大小的定量比较。此外，抗体相关荧光测量、缺乏细胞摄取量化以及缺少实验特异性阳性对照，均不能确立因果信号机制或明确的毒理学效应。因此，本研究的发现应被视为假设生成性的，需使用成人原代人肺成纤维细胞、生理相关的多细胞气液界面模型、直接摄取测量以及正交分子和功能测定进行验证。
