《Foods》：The Gut–Liver Axis Mediates Liver Injury Induced by Low-Molecular-Weight Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Through TLR4-Dependent Inflammation and Bile Acid Dysregulation
编辑推荐：
低分子量多环芳烃（low-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons, LMW-PAHs）是烧烤、烟熏及热加工食品中普遍存在的膳食污染物，然而其肝毒性机制尚不明确。研究人员建立了同时暴露于芴（fluore
低分子量多环芳烃（low-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons, LMW-PAHs）是烧烤、烟熏及热加工食品中普遍存在的膳食污染物，然而其肝毒性机制尚不明确。研究人员建立了同时暴露于芴（fluorene, Flu）和菲（phenanthrene, Phe）的低、中、高剂量大鼠模型，并通过尿液代谢物及结肠芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AHR）/细胞色素P450 1A1（cytochrome P450 1A1, CYP1A1）验证模型成功。研究人员评估了结肠屏障完整性、肠道菌群（gut microbiota, GM）组成、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）转运、肝脏炎症、氧化应激、脂质代谢及肠-肝代谢组学特征。Flu/Phe联合暴露降低了紧密连接蛋白表达并改变GM组成——表现为革兰氏阴性菌丰度增加及肠道健康指数下降——从而促进LPS转运并上调肝脏Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3, NLRP3）信号轴，该信号轴与炎症、氧化应激及脂质代谢紊乱相关。中剂量组呈现最显著效应，提示可能存在非单调剂量-反应关系。代谢组学分析显示，胆汁分泌是结肠和肝脏共有的最显著富集通路。在机制上，Flu/Phe联合暴露通过抑制法尼醇X受体（farnesoid X receptor, FXR）/小异源二聚体伴侣（small heterodimer partner, SHP）并上调胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1）和固醇12α-羟化酶（sterol 12α-hydroxylase, CYP8B1）破坏胆汁酸稳态。综上，这些发现表明LMW-PAHs通过两种不同机制诱导肝损伤：GM失调驱动的LPS/TLR4信号通路及FXR/SHP介导的胆汁酸失调。因此，肠-肝轴为LMW-PAH膳食风险评估提供了候选分子节点，但鉴于本研究的高剂量机制性设计，仍需在膳食相关剂量下进行验证。
### 一、研究背景与科学问题
多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）是一类由两个及以上稠合苯环组成的持久性有机污染物，广泛存在于大气、水和食品中。PAHs在食品加工过程中（如烟熏、烧烤、油炸）大量产生，膳食摄入是人体暴露的主要途径。PAHs进入机体后主要在肝脏代谢，经细胞色素P450酶（cytochrome P450 enzymes, CYPs）氧化加工生成环氧化物、邻醌等活性代谢物，可与肝细胞内DNA、RNA和蛋白质形成加合物，从而干扰正常肝细胞功能。
依据苯环数量，PAHs可分为高分子量PAHs（high-molecular-weight PAHs, HMW-PAHs，≥4环）和低分子量PAHs（low-molecular-weight PAHs, LMW-PAHs，<4环）。相较于HMW-PAHs，LMW-PAHs具有更高的水溶性和生物利用度，且在中国的城市空气监测中，菲（phenanthrene, Phe）和芴（fluorene, Flu）是最丰富的LMW-PAH种类。然而，既往PAHs肝毒性研究几乎全部聚焦于HMW-PAHs（如苯并[a]芘），关于LMW-PAHs通过肠-肝轴发挥肝毒性的机制几乎空白。
肠-肝轴是连接肠道与肝脏的双向通路，其核心组成包括肠道菌群（gut microbiota, GM）、门静脉和胆道系统。在生理条件下，肠道黏膜屏障可阻止脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）等有害代谢物经门静脉进入肝脏；当屏障受损时，LPS等抗原信号可进入门脉循环并诱发肝脏炎症反应。同时，肝脏通过胆汁酸代谢反向调节GM组成。现有研究表明，HMW-PAHs（如苯并[a]芘）可破坏肠道屏障、诱导GM失调并改变胆汁酸代谢，但LMW-PAHs是否通过相似机制致肝损伤尚不清楚。鉴于LMW-PAHs主要通过食物摄入，阐明其肝毒性机制对食品安全风险评估具有重要意义。基于此，研究人员建立Flu/Phe联合暴露大鼠模型，系统考察其对肝脏和结肠的影响，重点关注GM组成、肠道屏障完整性和肠-肝轴代谢组学。
### 二、主要技术方法
研究人员选用8周龄SPF级雄性Wistar大鼠（兰州兽医研究所，中国农业科学院），随机分为四组（每组8只）：对照组（C，玉米油）、低剂量组（L，Flu和Phe各13 mg/kg b.w./天）、中剂量组（M，各26 mg/kg b.w./天）和高剂量组（H，各130 mg/kg b.w./天），连续灌胃2个月。剂量依据Flu和Phe的口服LD50（1300 mg/kg）的1/100、1/50和1/10设定。每组中3只用于组织病理学分析，5只用于分子、生化、LPS、微生物组和代谢组学分析。研究采用的技术包括：高效液相色谱法检测尿液9-OH Phe和2-OH Flu；苏木精-伊红（H&E）染色和油红O（Oil Red O）染色评估组织病理学改变；生化试剂盒检测血清ALT、AST及肝脏NEFA、T-CHO、TG；ELISA检测LPS水平；16S rRNA基因测序分析GM组成；RT-qPCR和Western blot检测基因和蛋白表达；基于HPLC-MS的非靶向代谢组学分析肝脏和结肠内容物代谢谱。
### 三、研究结果
**3.1 尿液2-OH Flu和9-OH Phe水平及AHR/CYP1A1表达**
随着Flu/Phe暴露剂量增加，尿液2-OH Flu和9-OH Phe浓度显著升高（p < 0.05），最高分别达26.3 μg/mL和4.6 μg/mL。结肠和肝脏中AHR和CYP1A1的mRNA及蛋白水平在各暴露组均显著上调（p < 0.05），证实Flu/Phe联合暴露模型构建成功。
**3.2 组织病理学改变**
H&E染色显示，暴露组结肠出现不同程度的黏膜损伤、细胞形态异常、杯状细胞丢失和隐窝扭曲；肝脏出现肝索结构丧失、炎症细胞浸润和细胞间隙缩小，M和H组可见脂肪蓄积，其中M组脂变最显著。盲法半定量评分证实中剂量组肝结肠损伤最严重。
**3.3 结肠紧密连接蛋白表达**
联合暴露显著下调结肠ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA和蛋白水平（p < 0.05）。值得注意的是，ZO-1和Claudin-1在M组表达最低，而Occludin在H组达到最低，提示不同紧密连接蛋白对Flu/Phe暴露的敏感性存在差异。
**3.4 肠道微生态多样性改变**
16S rRNA测序显示，暴露组ACE、Chao1、Simpson和Shannon指数均显著降低（p < 0.05），NMDS分析显示暴露组与对照组显著分离。在门水平上，暴露组中Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteriota、Desulfobacterota等7个革兰氏阴性菌门相对丰度进行性增加。LEfSe分析鉴定出各组特征性细菌标志物，其中M组富集Bacteroides、Prevotella等属。
**3.5 肠道健康指标变化**
Firmicutes相对丰度随剂量增加而显著降低（p < 0.05），在H组达最低；Bacteroidetes在M组显著高于其他组（p < 0.05）。M组出现最显著的微生物失衡，且与肝脂肪变性和炎症细胞浸润程度密切相关。
**3.6 LPS转位与肝脏TLR4信号通路激活**
暴露组结肠内容物、血清和肝脏中LPS水平均显著升高（p < 0.05），以M组最高。肝脏TLR4、MyD88和NLRP3的mRNA及蛋白表达在暴露组显著上调（p < 0.05），与LPS蓄积模式一致，但研究未直接检测caspase-1裂解和ASC寡聚化，故功能性NLRP3炎性小体激活未被直接证实。
**3.7 肝脏损伤标志物与脂质代谢紊乱**
M和H组血清ALT和AST水平显著升高（p < 0.05），且M组显著高于H组。暴露组肝脏NEFA、T-CHO和TG水平均显著升高（p < 0.05），以M组增幅最大。油红O染色证实暴露组肝脏脂滴面积显著增加（p < 0.05），M组蓄积最严重。PPAR-α表达在L和H组降低但在M组升高，PPAR-γ在暴露组呈上升趋势（M组最显著），FABP1在M和H组升高（M组最显著），提示M组脂质代谢失调最突出。
**3.8 肝脏炎症与氧化应激**
暴露组促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平呈升高趋势，M组升高最显著；抗炎因子IL-10在各暴露组也显著升高，但M组低于L和H组。氧化应激方面，暴露组SOD活性显著降低（p < 0.05），MDA和8-OHdG水平显著升高（p < 0.05），表明肝脏抗氧化能力明显下降。
**3.9 肠-肝轴代谢组学分析**
PLS-DA显示C组与M组在结肠内容物（R2Y = 0.999, Q2 = 0.921）和肝脏（R2Y = 0.996, Q2 = 0.967）中均显著分离。共鉴定出结肠内容物403个差异代谢物（101个下调，302个上调）和肝脏939个差异代谢物（406个下调，533个上调）。KEGG通路富集分析确定胆汁分泌为结肠和肝脏共有的最显著富集通路。
**3.10 胆汁酸代谢改变**
代谢组学鉴定出31种胆汁酸代谢物（均为推定注释，未经标准品确认）。结肠内容物中9种代谢物上调、4种下调，肝脏中8种上调、9种下调。分子机制研究显示，联合暴露显著降低肝脏FXR和SHP的mRNA及蛋白表达（p < 0.05），同时显著升高CYP7A1和CYP8B1的表达（p < 0.05），表明Flu/Phe通过抑制FXR/SHP反馈调控并上调胆汁酸合成酶来破坏胆汁酸稳态。
### 四、讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员指出本研究的实验设计能够直接证明Flu/Phe联合暴露破坏肠道屏障、诱导GM失调、升高LPS、上调肝脏TLR4/MyD88/NLRP3表达、改变FXR/SHP/CYP7A1/CYP8B1轴并诱导肝脏炎症、氧化应激和脂质蓄积。但以下机制联系属于推断性而非直接证实：（1）革兰氏阴性菌对LPS升高的因果贡献；（2）功能性NLRP3炎性小体激活；（3）胆汁酸失调对肝损伤的因果作用。研究存在以下局限：非靶向代谢组学未能完全明确特定胆汁酸的精确身份和含量；代谢组学分析仅限于对照组和中剂量组；中剂量组效应强于高剂量组的现象提示可能存在非单调剂量-反应关系，但需正式剂量-反应建模加以确认；仅使用雄性Wistar大鼠以排除雌激素的保护性混杂效应。未来需通过粪菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）、LPS中和实验、FXR/SHP通路特异性干预以及无菌动物模型来验证这些因果推断。
研究结论部分：综上所述，本研究表明Flu/Phe联合暴露诱导GM失调——以革兰氏阴性菌比例增加为特征——并损害肠道屏障完整性，使LPS经肠-肝轴转位至肝脏。肝脏LPS随后上调TLR4/MyD88/NLRP3信号轴，该轴与炎症、氧化应激和脂质代谢紊乱相关。同时，Flu/Phe联合暴露通过抑制FXR/SHP轴并上调CYP7A1和CYP8B1破坏胆汁酸代谢，进一步加重肝损伤。中剂量组在多个终点表现出最强的表型（M > H > L），但这是否反映真实的非单调剂量-反应关系需经正式剂量-反应建模确认，不能仅从观察到的组间差异得出结论。该剂量可用于后续机制验证研究，如FMT、LPS中和或TLR4抑制。这些发现为LMW-PAHs诱导的肝损伤提供了机制框架，并确定了潜在治疗靶点——包括革兰氏阴性菌、TLR4通路和FXR/SHP轴——用于LMW-PAH相关肝损害的预防和治疗。本研究的暴露剂量超出实际膳食摄入量，因此应将其解读为高剂量机制毒理学模型而非环境或膳食相关暴露模型。所识别的分子节点能否作为LMW-PAH污染风险评估的生物标志物，需在膳食相关暴露水平下进行验证。
