《Foods》：Production Yield and Meat Quality Characteristics of Six Pork Head Cuts from Commercial Crossbred Pigs
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本研究利用原位和体外模型试验，结合理化分析、多光谱技术、分子对接和分子动力学（MD）模拟，探究了咖啡酸（CA）对肉类的颜色稳定作用及其与肌红蛋白（Mb）的互作机制。研究人员选取三头24月龄西门塔尔杂交阉牛胴体，获得12块牛排（每头4块）。将牛排分为三个处理组：
本研究利用原位和体外模型试验，结合理化分析、多光谱技术、分子对接和分子动力学（MD）模拟，探究了咖啡酸（CA）对肉类的颜色稳定作用及其与肌红蛋白（Mb）的互作机制。研究人员选取三头24月龄西门塔尔杂交阉牛胴体，获得12块牛排（每头4块）。将牛排分为三个处理组：对照组（去离子水）、0.05%（w/v）CA组和0.1%（w/v）CA组。样品在4±0.5°C条件下贮藏7天，采用聚氯乙烯（PVC）膜包裹，模拟零售展示条件。贮藏试验表明，0.1% CA显著延缓了牛肉褐变并维持了其红色。理化分析显示，CA抑制了高铁肌红蛋白（MetMb）的形成达6%，降低了Mb的溶解度，并使表面疏水性下降约90%。荧光光谱证实，CA与Mb之间的相互作用由氢键和范德华力驱动，产生静态猝灭机制，在293 K下结合常数为259.41×103 L/mol。此外，紫外可见光谱和傅里叶变换红外光谱表明，CA结合后Mb发生了结构调整。差示扫描量热法（DSC）显示热变性温度升高。原子力显微镜（AFM）显示CA诱导了Mb聚集。一致地，分子对接和MD模拟揭示，CA主要通过非共价相互作用（如氢键）与Mb分子结合。综上所述，这些发现为CA作为天然肉制品颜色稳定剂的应用提供了理论基础。
研究背景与研究意义
肉色是消费者判断肉类品质的重要指标，鲜红色通常促进销售，而色泽劣化则导致严重经济损失。据报道，美国因肉变色造成的年经济损失超过10亿美元。宰后肌肉的颜色主要由肌红蛋白（Mb）的含量和化学状态决定。Mb存在三种形式：脱氧肌红蛋白（DeoxyMb，紫红色）、氧合肌红蛋白（OxyMb，亮红色）和高铁肌红蛋白（MetMb，棕褐色）。保持亮红色的关键在于抑制MetMb的形成。现有护色策略包括真空包装、高氧气调包装等物理方法，以及亚硝酸盐、乳酸盐等小分子盐类化合物。近年来，植物提取物因其天然抗氧化特性受到关注，其中多酚类物质可通过清除自由基、螯合金属离子等方式延缓Mb氧化。咖啡酸（CA）作为一种天然羟基肉桂酸类酚酸，具有邻二羟基结构，表现出优异的抗氧化活性。然而，CA与Mb之间特定的非共价相互作用机制及其对肉色稳定性的潜在影响尚未被系统阐明。因此，本研究旨在探索不同浓度CA对Mb构象和微观结构的影响，并利用分子模拟技术预测其结合位点与作用力，为CA作为天然肉色稳定剂的应用提供理论依据。
主要关键技术方法
研究人员采用了多种技术手段：利用紫外可见分光光度法测定MetMb相对含量；通过溴酚蓝（BPB）结合法评估表面疏水性；采用差示扫描量热法（DSC）评价热稳定性；应用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和紫外可见吸收光谱分析结构变化；使用同步荧光和内源荧光光谱研究结合机制；借助原子力显微镜（AFM）观察微观形貌；并通过CB-Dock2在线工具进行分子对接，在WeMol平台运行GROMACS 2023进行100纳秒分子动力学（MD）模拟。所有数据均经IBM SPSS 26进行单因素方差分析和Tukey多重比较检验。
研究结果
3.1 CA对肉色的保护效果分析
通过为期7天的贮藏实验，研究人员观察到0.05%和0.1% CA处理的牛肉样品褐变程度明显轻于对照组。色度参数测量显示，CA处理未显著改变亮度L值。在红度a方面，第5天时对照组a值降至11.40，而0.05%和0.1% CA处理组分别维持在15.76和16.65，差异显著；第7天时CA处理组仍保持约10.9的红度，对照组仅为8.11。黄度b值在第5和第7天时，0.1% CA处理组显著高于对照组。这表明CA特别是0.1%浓度能有效延缓牛肉零售展示期间的变色。
3.2 MetMb%、溶解度、表面疏水性和DSC分析
MetMb含量测定显示，随着CA浓度从3.125 μM增至100 μM，MetMb含量呈整体下降趋势，12.5至100 μM范围内与对照组相比差异极显著。溶解度测试表明，CA以剂量依赖性方式显著降低Mb溶解度，从对照组的约90%降至100 μM时的约60%。表面疏水性分析显示，BPB结合量随CA浓度增加单调递减，100 μM时结合量仅约2 μg，较对照组减少约90%。DSC结果显示，纯Mb的变性峰温Tmax为82.37°C，加入100 μM CA后升至132.95°C，提高了61.41%。
3.3 荧光光谱分析
荧光发射光谱显示，随着CA浓度增加，Mb在约340 nm处的荧光强度规律性下降，呈现静态猝灭特征。Stern-Volmer图线性良好，双分子猝灭速率常数Kq达1012 L/(mol·s)，远大于生物大分子的扩散控制极限2.0×101? L/(mol·s)。结合常数Ka随温度升高显著降低，从293 K时的259.41×103 L/mol降至305 K时的46.66×103 L/mol，结合位点数n接近1。热力学参数ΔG为负值表明自发结合，ΔH和ΔS均为负值，说明氢键和范德华力是主要驱动力。
3.4 FT-IR、UV-Vis吸收光谱和同步荧光光谱分析
FT-IR分析显示，CA处理后Mb的酰胺I带和酰胺II带发生波数位移和强度变化，表明CA改变了Mb二级结构的氢键网络环境。UV-Vis光谱中，CA导致Mb在409 nm处Soret带吸光度显著降低并伴有轻微峰位移动，同时280 nm处吸光度也下降，表明CA可能结合在血红素口袋附近并影响芳香族氨基酸残基微环境。同步荧光光谱中，Δλ=15 nm反映酪氨酸残基，Δλ=60 nm反映色氨酸残基，两者均出现荧光猝灭和最大发射波长蓝移，表明CA结合使这些残基周围极性降低、疏水性增强。
3.5 AFM分析
AFM图像显示，纯Mb呈均匀分散的球状颗粒，Z轴高度仅0-3.3 nm。低浓度CA（3.125-12.5 μM）诱导Mb开始聚集，表面粗糙度增加，Z轴高度升至12-23 nm。高浓度CA（25-100 μM）导致大规模聚集甚至形成原纤维样链状结构，100 μM时Z轴高度达39 nm。
3.6 分子对接和分子动力学模拟分析
分子对接表明CA嵌入Mb的疏水腔，与Lys87、Glu148和Asn145形成氢键，并与Ala81、His82和Asp141产生疏水和π-烷基相互作用。100 ns MD模拟轨迹分析显示：RMSD曲线表明Mb-CA复合物骨架稳定性增强；RMSF分析显示除特定柔性环区外波动幅度较低；氢键数目在整个模拟过程中保持稳定；回转半径Rg略小于游离Mb，表明结构更紧凑；溶剂可及表面积SASA分析显示总表面积稳定，疏水SASA显著降低；自由能景观FEL显示复合物具有深而窄的全局能量最小值，约为-40 kJ/mol。
讨论与结论
讨论部分指出，CA通过三条途径发挥护色作用：直接清除自由基中断氧化链反应；与Mb直接结合并稳定其构象；在还原剂存在下将已形成的MetMb还原回OxyMb。溶解度降低可能源于CA与Mb表面氨基酸残基结合导致亲水性下降，而非蛋白质变性。表面疏水性降低归因于CA竞争性结合或诱导构象变化掩埋疏水区域。DSC结果证实CA显著提高Mb热稳定性。荧光光谱确认静态猝灭机制和1:1结合比。FT-IR和UV-Vis光谱证实CA诱导Mb二级结构调整并影响血红素微环境。AFM直观展示了CA诱导的Mb聚集现象。MD模拟系统揭示了CA结合使Mb进入更低自由能的稳定紧凑构象态。
研究结论：CA通过非共价相互作用（氢键、疏水力等）与Mb结合，诱导Mb结构和功能调节。0.1% CA在肉贮藏实验中有效保持鲜红色并延缓褐变。CA保护了疏水区域并增强了亲水性，抑制MetMb形成达6%。荧光光谱和分子对接鉴定出具体结合残基并确认约1:1摩尔比。CA增强了Mb的整体刚性，表现为RMSD降至0.1 nm，热稳定性提升至132.95°C。MD模拟揭示CA限制构象漂移，稳定了具有更低自由能（-40 kJ/mol）的紧凑结构。该研究建立了基于多酚的肉色保鲜分子框架，突出了CA替代合成添加剂的多功能天然机制，为开发可持续肉色保鲜技术提供了蓝图。
