基于银-细菌纤维素-槟榔提取物纳米复合生物膜的可持续食品包装材料：合成、表征及抗菌活性研究

《Molecules》：Silver-Bacterial Cellulose-Areca catechu Extract Nanocomposite Biofilm for Sustainable Food Packaging: Synthesis, Characterization, and Antibacterial Activity

　　

摘要 细菌纤维素（bacterial cellulose, BC）是一种低成本、可生物降解的生物聚合物，具有优异的机械强度和保水能力，是可持续食品包装的理想材料；然而，天然BC缺乏内在抗菌活性。本研究通过原位还原法在BC膜上还原Ag+，随后浸渍浓度为0–30 mg/mL的槟榔（Areca catechu）果实提取物，合成了银-细菌纤维素-槟榔提取物纳米复合生物膜。研究人员采用扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDX）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、溶胀能力和颜色分析对所得膜进行了表征，并利用纸片扩散法评估了其对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌活性。SEM-EDX证实银纳米颗粒成功沉积于BC基质内，FTIR和XRD结果表明膜改性后官能团和结晶度发生变化。膜的溶胀能力约为145%–370%，其中含20 mg/mL提取物的膜溶胀能力最高。含10 mg/mL提取物的膜抗菌活性最强，对S. aureus和E. coli的抑菌圈均为6.50 mm，优于纯BC膜、Ag-BC膜及更高浓度配方。液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）分析槟榔提取物，初步鉴定出120余种代谢物，以槟榔碱（arecoline）和去甲槟榔碱（guvacoline）等生物碱为主，其他检测到的代谢物包括儿茶素（catechin）、原儿茶酸（protocatechuic acid）、青霉酸（penicillic acid）、圆柚酮（nootkatone）和植物鞘氨醇（phytosphingosine）等已知具有抗菌活性的化合物。综上，本研究表明所开发的纳米复合生物膜作为低成本、环境友好的抗菌材料具有广阔前景，有望进一步开发为活性食品包装材料。但其食品接触应用的安全性及迁移性评估仍需进一步研究。

银-细菌纤维素-槟榔提取物纳米复合生物膜：可持续食品包装材料的创新探索

一、研究背景与问题

石油基塑料包装废弃物的累积已成为紧迫的环境问题。塑料包装材料难以降解，可在环境中长期存留，并逐渐碎裂为微塑料，对人体健康构成潜在风险。这一困境推动了食品工业对可生物降解和可再生材料的日益关注。在众多候选生物聚合物中，细菌纤维素（bacterial cellulose, BC）凭借其高纯度、优异机械强度、良好保水能力和可生物降解性而备受瞩目。BC可由椰子水废液等农业副产物生产，兼具环境效益和经济效益。然而，天然BC缺乏内在抗菌活性，这一局限限制了其作为能够抑制食品腐败菌和食源性病原微生物生长的活性包装材料的直接应用。

为赋予抗菌功能，银纳米颗粒（AgNPs）被广泛引入包括BC在内的生物聚合物基质中。AgNPs对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有广谱抗菌活性，Ag-BC复合膜因此被探索作为结合BC机械与阻隔性能及银抗菌作用的活性食品包装材料。然而，仅依赖AgNPs存在成本及细菌耐药风险等问题，这促使研究者寻找可与Ag-BC体系联用的植物源抗菌剂以增强其生物活性。槟榔（Areca catechu L.）果实富含生物碱（如槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱）、鞣质、黄酮类及其他酚类化合物，已有研究报道这些化合物具有抗菌、抗氧化和抗炎特性。尽管潜力巨大，槟榔果实仍是利用不足的资源，其作为活性包装功能成分的增值化开发尚未得到广泛探索。将AgNPs与BC及槟榔提取物结合，有望开发出多功能纳米复合膜，其中植物提取物可与银协同增强抗菌性能。

二、研究内容与意义

本研究以0–30 mg/mL的提取物浓度合成了银-细菌纤维素-槟榔提取物纳米复合生物膜，并对其形貌、元素组成、官能团、结晶度、溶胀能力和颜色特性进行了表征。研究人员评估了所得膜对食品相关病原菌——大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抗菌活性，并通过LC-HRMS分析了槟榔提取物的植物化学组成，以鉴定可能负责抗菌活性的生物活性成分。该研究旨在为开发Ag-BC-槟榔纳米复合生物膜作为可持续抗菌包装材料提供科学依据，同时实现椰子水废液和利用不足的槟榔果实的资源化增值。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术手段：利用椰子水废液合成细菌纤维素膜；通过原位还原法将硝酸银中的Ag⁺在BC膜上还原为Ag⁰，随后将膜浸渍于不同浓度（0、10、20、30 mg/mL）的槟榔乙醇提取物中制备复合膜；采用扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDX）观察膜表面形貌并确认元素组成；利用X射线衍射（XRD）分析膜的结构和结晶度，采用Scherrer方程和Segal结晶度指数计算晶粒尺寸和结晶度；通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）评估膜的官能团；采用溶胀试验测定膜的吸水能力；使用色差仪记录CIE颜色参数（L*、a*、b*）；利用纸片扩散法评估膜对E. coli（ATCC 8739）和S. aureus（ATCC 25923）的抗菌活性；采用液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）结合Compound Discoverer 3.2软件，参照mzCloud和ChemSpider数据库对槟榔提取物进行代谢物鉴定。

四、研究结果

4.1 形貌与EDX分析

SEM观察显示，纯BC具有特征性的三维互连纳米纤维网络，纳米纤维宽度约为26–50 nm。未添加槟榔提取物的Ag-BC膜中，银沉积几乎完全覆盖了BC的纳米纤维网络，银颗粒严重聚集，粒径约100–125 nm。加入槟榔提取物后（10–20 mg/mL），BC的纳米纤维网络重新可见，表明提取物中的植物化学物质可作为封端剂和稳定剂，控制银颗粒生长并减少聚集，使银均匀分布于BC表面。然而，当提取物浓度增至30 mg/mL时，纳米纤维结构再次不可见，这归因于过量提取物在BC表面形成薄层生物有机覆盖层。EDX分析确认纯BC中无银峰；Ag-BC膜中银元素含量为0.6%；加入10 mg/mL提取物后银含量降至0.1%，20 mg/mL时升至0.3%，30 mg/mL时保持0.3%，表明银沉积在20 mg/mL时已达饱和。

4.2 FTIR研究

槟榔提取物的FTIR谱图显示丰富的植物化学特征，包括3268 cm^?1处的O-H伸缩振动峰（多酚和水分子的羟基）、2916和2846 cm^?1处的脂肪族C-H伸缩振动峰、1700 cm^?1处的羰基（C=O）或酯基伸缩振动峰、1600 cm^?1处的C=C芳香环伸缩振动峰，以及1155、1103、1058 cm^?1处的C-O-C和C-O伸缩振动峰。纯BC呈现典型的纤维素指纹峰。Ag-BC膜中纤维素核心骨架基本保持完整，但羟基区域（3268 cm^?1）的强度和位置发生细微变化，表明银纳米颗粒与纤维素基质羟基氧之间存在弱非共价或静电相互作用。加入槟榔提取物后，BC的主要特征峰均得以保留，确认纤维素基质结构完整性未受损害。随着提取物浓度增加，多酚相关官能团（O-H伸缩和C=C芳香环伸缩）的峰强度呈浓度依赖性变化并出现峰展宽，1700 cm^?1峰仅存在于槟榔提取物中，表明槟榔植物化学物质、银纳米颗粒和BC基质之间存在氢键和配位相互作用。

4.3 XRD研究

XRD图谱显示，所有样品在2θ≈21–22°处均存在纤维素相关衍射峰，而42.71°、63.25°和80.72°处的反射在纯BC中已存在，不能特异性归因于金属银。与既往Ag/BC复合材料报道中在38.1°、44.2°、64.4°和76.7°处出现的面心立方银特征反射不同，本研究中未清晰检测到这些反射，可能与银含量较低或银域结晶度不足有关。因此，XRD单独不能为膜中晶态金属银提供确证证据，银的存在和空间分布由EDX谱图和EDS元素分布图独立支持。结晶度指数（CrI）方面，纯BC为51.26%，Ag-BC为80.93%，含10 mg/mL提取物的膜为81.31%，含20 mg/mL提取物的膜显著降至28.38%，而30 mg/mL处理因纤维素相关反射检测不足而无法可靠确定。Scherrer方程估算的晶粒尺寸分别为5.25、5.68、5.77和6.31 nm。研究人员强调，Ag处理后较高的CrI不应被解释为银促进了纤维素结晶，因为这些数值代表处理膜之间纤维素结构有序性的相对变化。

4.4 溶胀能力

溶胀试验显示五种膜配方之间存在显著差异。纯BC的溶胀率约为234%，可吸收约2.3倍自身重量的水。Ag的引入使溶胀能力增至约350%。加入槟榔提取物后，溶胀能力随浓度不同而降低或升高：含20 mg/mL提取物的Ag-BC-槟榔2膜溶胀能力最高，达370%；而含10 mg/mL和30 mg/mL提取物的膜溶胀能力有所降低。溶胀能力增加可能归因于银的孔隙性和亲水性。溶胀能力与材料吸收水分的能力相关，有助于保护食品免受过多湿度影响并维持品质，但过度溶胀可能损害机械完整性。因此，该生物膜适用于有限水分暴露的食品包装场景，而长期用于高水分含量食品需进一步评估其在潮湿条件下的机械稳定性和阻隔性能。

4.5 颜色测量

颜色分析显示，将槟榔提取物引入膜配方后，亮度（L*）降低，红度（a*）和黄度（b*）增加，各膜间L*、a*、b*值差异显著（p < 0.05）。纯BC的L*值为43.25 ± 0.34，为所有膜中最高；Ag-BC、Ag-BC-槟榔1、Ag-BC-槟榔2和Ag-BC-槟榔3的L*值分别为30.80 ± 0.10、35.16 ± 0.22、31.50 ± 0.33和35.42 ± 0.18。a*值从BC的?0.54 ± 0.03升至Ag-BC-槟榔3的6.42 ± 0.90，表明红度增加；随槟榔浓度增加，b*值从12.72 ± 0.55降至10.48 ± 0.38。膜颜色变化归因于槟榔提取物中的酚类化合物，其中儿茶素和表儿茶素是主要贡献成分。

4.6 抗菌活性

纸片扩散法抗菌试验表明，含10 mg/mL提取物的膜C对S. aureus和E. coli的抑菌圈均为6.50 mm，为所有测试膜中最高，优于纯BC膜、Ag-BC膜及更高浓度配方。对S. aureus而言，抑菌活性排序为膜C > 膜B > 膜E > 膜D；对E. coli而言，排序为膜C > 膜E > 膜B > 膜D。阳性对照阿莫西林对S. aureus和E. coli的抑菌圈分别为16.75 mm和16.50 mm。银纳米颗粒通过多重同步机制发挥抗菌作用，包括与细菌细胞膜相互作用并造成损伤、诱导活性氧（ROS）产生、引起蛋白质泄漏和DNA凝聚等。槟榔提取物的抗菌特性归因于果实中存在的黄酮类、鞣质、皂苷和生物碱，这些化合物可破坏细菌细胞壁并抑制生长。

4.7 LC-HRMS分析

LC-HRMS分析揭示槟榔果实提取物含有多种植物化学物质，以生物碱和多酚衍生物为主。主要初步鉴定化合物包括生物碱类：槟榔碱（33.5%）、烟醇（10.3%）、去甲槟榔碱（5.8%）、咖啡因（3.2%）、甜菜碱（2.9%）、异烟酸甲酯和氨甲环酸；脂类及脂溶性化合物：9-氧代-10(E),12(E)-十八碳二烯酸、2-[(5Z)-5-十四烯基]环丁酮、9,10-二羟基硬脂酸、12,13-DiHOME、硬脂酰胺、棕榈油酸乙酯、植物鞘氨醇、圆柚酮和α-桐酸；酚类和黄酮类化合物：儿茶素（cyanidanol）和原儿茶酸。这些分子已被报道具有抗菌活性：咖啡因通过抑制RNA合成抑制细菌；儿茶素与细胞膜相互作用，穿透磷脂并引起通透性破坏；氨甲环酸与万古霉素和庆大霉素等抗生素具有协同作用，可通过抑制细菌聚集破坏生物膜形成；植物鞘氨醇通过损伤细胞质膜导致细胞裂解，活性迅速；圆柚酮对单核细胞增生李斯特菌和白喉棒杆菌等革兰氏阳性杆菌具有抑菌和杀菌活性，并通过抑制S. aureus生物膜形成相关基因（sarA、icaA、agrA）的表达有效抑制生物膜形成；原儿茶酸破坏细胞膜完整性，引起膜去极化、胞内pH降低及ATP和钾离子泄漏。

五、讨论与结论

本研究成功开发了具有潜在活性食品包装应用前景的可持续Ag-BC-槟榔提取物纳米复合生物膜。银纳米颗粒和槟榔提取物的引入赋予BC基质多功能特性，增强了其物理化学和抗菌性能。综合表征确认了纳米复合材料的成功形成，并展示了有利的结构、形貌和功能特征。该生物膜对S. aureus和E. coli表现出显著抗菌活性，凸显了银纳米颗粒与槟榔提取物中生物活性植物化学物质的协同抗菌效应。这些发现表明，所开发的纳米复合生物膜是传统石油基食品包装材料的环保替代品。然而，本研究未评估膜的机械强度以及银/槟榔成分向食品或食品模拟物的迁移情况，因此膜的食物接触安全性和适用性尚未确立。未来工作应纳入机械强度、生物降解行为及真实食品储存系统中的有效性评估，以促进其在食品包装行业的应用；此外，还需进行额外的毒理学和食品接触安全性评估，以确认复合膜用于食品包装的适宜性。