《Vaccines》：Micro-Flow Imaging and Flow Virometry as Preferred Methods to Monitor Aggregate Formation in the Submicron and Subvisible Size Range for Two Early-Phase Vaccine Candidates
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摘要专业翻译
背景： 疫苗样品中非预期颗粒的形成有可能降低产品效力并影响免疫原性。因此，监管机构常规要求对微米尺寸范围内的颗粒进行放行检测。颗粒可能以多种形式存在，既可以是内在的（例如，来源于蛋白质聚集体），也可以是外来的（例如，来自管路的硅油或生产过程中的污
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背景： 疫苗样品中非预期颗粒的形成有可能降低产品效力并影响免疫原性。因此，监管机构常规要求对微米尺寸范围内的颗粒进行放行检测。颗粒可能以多种形式存在，既可以是内在的（例如，来源于蛋白质聚集体），也可以是外来的（例如，来自管路的硅油或生产过程中的污染），其尺寸范围可从亚微米延伸至可见尺寸范围。近年来，人们越来越关注开发检测和监测聚集颗粒的方法，并且除了药典方法常规监测的亚可见范围外，还期望评估亚微米颗粒的粒径和浓度。方法： 通常采用的技术包括利用光散射或成像的生物物理分析方法。本研究评估了动态光散射（DLS）、微流成像（MFI）和流式病毒计数法作为检测和监测亚微米至微米尺寸颗粒的方法。结果： 这些方法能够评估人巨细胞病毒（HCMV）疫苗候选物的原料药（DS）和成品药（DP）样品的稳定性和可加工性。对于这种减毒活病毒疫苗候选物，MFI和流式病毒计数法被证明是在潜在聚集体的完整尺寸范围内监测聚集体形成的最灵敏方法。这些已建立的方法被应用于柯萨奇病毒A21疫苗候选物的工艺和制剂筛选。结论： MFI对持续搅拌胁迫样品中亚可见颗粒浓度的变化最为敏感，而流式病毒计数法则捕获了搅拌以及剪切池再循环胁迫后亚微米颗粒的变化。这种将多种分析方法相结合以筛选完整聚集颗粒尺寸范围，并辅以广泛强制聚集条件的综合筛选方法，为疫苗制剂候选物及其他生物制品等模式的筛选和开发提供了一个框架。
论文解读
一、研究背景与目的
人巨细胞病毒（HCMV）是一种常见的疱疹病毒，全球血清阳性率估计为83%，可导致婴儿神经发育障碍和免疫受损成人的致命性疾病。本研究的HCMV疫苗候选物是一种源自AD169株的减毒活病毒疫苗，其抗原包含多种病毒颗粒，包括感染性病毒粒子、非感染性包膜颗粒（NIEPs）和致密体，尺寸范围从150 nm到至少400 nm。由于这些病毒颗粒体积较大且结构复杂，其处理和生产过程可能促进粒径增大或聚集。这些聚集体范围从亚微米到亚可见颗粒尺寸，可能进一步传播聚集，对免疫原性和产品效力产生负面影响，还可能导致无菌过滤过程中的堵塞，造成物料损失、产率降低和放行延迟。
监管机构根据ICH Q4B要求，对注射剂放行检测中亚可见范围内的颗粒物质进行监测。然而，对于早期开发阶段的新型疫苗，由于经验有限、材料稀缺、数据集小，对聚集体形成的了解较少。此外，许多疫苗制剂本身含有佐剂或其他颗粒，难以区分期望与非期望颗粒。因此，开发产品特异的聚集理解需要使用预测性和相关性强制的聚集方法，并结合适当的区分性分析方法。
二、研究内容与结论概述
研究人员对来自默克公司的HCMV疫苗候选物原料药（DS）和成品药（DP）施加机械和热胁迫以诱导聚集，评估了动态光散射（DLS）、微流成像（MFI）和流式病毒计数法三种方法在跨越亚微米和亚可见颗粒尺寸范围的聚集体检测能力。结果表明，DLS对该疫苗候选物的聚集检测灵敏度不足，而MFI和流式病毒计数法被证明是最灵敏的方法。这些已建立的方法进一步应用于柯萨奇病毒A21疫苗候选物的工艺和制剂筛选。
三、关键技术与方法
本研究主要采用了三种核心分析技术：动态光散射（DLS），使用Malvern Zetasizer Nano ZS测量亚微米颗粒尺寸；微流成像（MFI），使用Protein Simple MFI 5200系统测量大于2 μm且高达70 μm的亚可见颗粒浓度；流式病毒计数法，使用Apogee A-50 Micro流式细胞仪检测约70 nm以上的亚微米至微米颗粒。HCMV DS样品包括含可见颗粒的Lot A和对照Lot B，以及用于热稳定性研究的Lot C和Lot D；DP样品为一批冻干制剂复溶后使用；柯萨奇病毒A21 DS样品用于工艺筛选。胁迫条件包括搅拌、旋转、涡旋、热孵育（37 °C和60 °C）、冻融以及通过蠕动泵配合剪切池进行再循环。
四、研究结果
4.1 评估DLS、MFI和流式病毒计数法检测聚集的方法能力
DLS分析显示，聚集样品与Lot B对照之间的平均粒径仅有轻微增加。Lot A仅显示30 nm的增加，但仅观察到单一主峰，多分散性增加但无法揭示大颗粒的精确尺寸。DLS无法检测微米尺寸范围的颗粒，使其不适合作为常规放行检测的主要聚集方法。
MFI测量显示，Lot B搅拌2 h和26 h后颗粒浓度增加2倍，Lot A比对照增加8倍。37 °C孵育48 h和旋转24 h后颗粒浓度分别降低3倍和2倍。MFI能够显示Lot B对照与Lot A之间颗粒浓度（1–70 μm）的显著差异。
流式病毒计数法显示，Lot A总颗粒浓度比Lot B对照增加16倍。Lot B在37 °C孵育48 h后颗粒浓度增加16倍，搅拌26 h增加7倍，旋转24 h增加5倍，搅拌2 h增加2倍。流式病毒计数直方图显示搅拌随时间推移尺寸分布向更大颗粒方向偏移。
4.2 通过MFI和流式病毒计数法监测HCMV成品药的聚集体形成
MFI测量显示，60 °C孵育4 h后大于5 μm颗粒浓度增加2倍，孵育1天后增加22倍。涡旋60 s后立即测量亚可见颗粒增加5倍，3天后测量增加10倍，表明涡旋的剪切应力可能引发额外聚集体形成。蠕动泵再循环（有无剪切池）以及搅拌对亚可见颗粒浓度影响较小。
流式病毒计数法显示，大于750 nm的聚集体百分比在大多数胁迫条件下增加。最大增幅来自搅拌24 h，其次是涡旋和500次再循环的剪切池泵送。涡旋样品3天后测量的颗粒浓度高于当天测量。无剪切池的泵送对颗粒浓度无影响。聚集DP样品中总颗粒浓度呈下降趋势，与聚集DS样品中观察到的尺寸分布偏移一致。
4.3 通过MFI和流式病毒计数法监测HCMV原料药热稳定性期间的聚集体形成
经过验证的MFI和流式病毒计数法方法被应用于HCMV DS热稳定性研究。Lot C在2–8 °C储存4个月内MFI颗粒浓度保持稳定。速冻后观察到5倍增加，随后在?70 °C储存期间保持稳定。搁架冷冻材料在?70 °C储存时颗粒浓度逐渐增加，4个月时比T0增加5倍。Lot D在2–8 °C储存6个月内颗粒浓度增加2倍，?70 °C搁架冷冻材料6个月时增加5倍。
流式病毒计数法显示Lot D在2–8 °C时聚集体百分比增加3倍，速冻后增加5倍，速冻后?70 °C储存最高增加10倍。搁架冷冻在?70 °C时聚集体百分比稳定增加，6个月时增加6倍。储存温度对Lot D的聚集体百分比有显著影响，2–8 °C储存6个月增加51倍，而?70 °C仅增加2倍。Lot C对冷冻更敏感，亚微米和亚可见范围均有颗粒增加，而Lot D对2–8 °C储存更敏感，主要增加亚微米颗粒。
4.4 监测柯萨奇病毒A21原料药的聚集体形成
柯萨奇病毒A21 DS在所有胁迫条件下均观察到总颗粒浓度增加。MFI显示搅拌24 h后颗粒浓度增加最显著。流式病毒计数法显示除搅拌1 h和涡旋10 s外，所有胁迫条件均观察到颗粒浓度增加，其中剪切池再循环和搅拌24 h增幅最大。长时间搅拌和涡旋以及1000次再循环对亚可见范围影响最大，而搅拌和再循环在亚微米范围触发显著增加。
五、讨论与结论
目前尚无药典方法监测疫苗产品中的聚集体。虽然SEC、NTA和DLS常用于检测聚集体粒径，但各有局限性。SEC因静电和疏水相互作用常导致蛋白质聚集体回收率低；NTA和DLS因大颗粒布朗运动减弱而无法准确测量大于1 μm的颗粒；DLS以批处理模式输出平均尺寸，低水平大聚集体的影响可能被主颗粒的强光散射强度掩盖。本研究证明MFI和流式病毒计数法结合使用可在最广泛的尺寸范围内提供全面的颗粒信息，填补了常规颗粒表征的空白。
强制胁迫条件模拟了真实世界条件。对于HCMV，剪切应力和热孵育对DS和DP的颗粒形成影响最大。搅拌产生亚可见颗粒，37 °C热孵育更有效形成亚微米颗粒。涡旋60 s和60 °C热孵育在亚可见范围产生更多聚集体，而搅拌、剪切池再循环和60 °C热孵育在亚微米范围最具信息量。不同胁迫条件产生不同尺寸范围的聚集体，强调了全面筛选亚微米和亚可见颗粒的必要性。
本研究表明，对于HCMV疫苗候选物，MFI和流式病毒计数法被证明是检测聚集最灵敏的方法。流式病毒计数法可监测约200 nm的主病毒颗粒以及亚微米范围上限形成的聚集体，MFI则提供亚可见范围颗粒形成的补充信息。这种结合多种分析方法与广泛强制聚集条件的综合筛选方法，为疫苗制剂筛选和开发提供了框架，也可应用于生物制品等其他模式。未来研究可能包括静态光散射、全息显微镜以及荧光免疫染色结合流式病毒计数法以阳性鉴定聚集体组成。
