《Water》：Do Free-Living Amoebae Serve as a Shelter for Helicobacter pylori in Istanbul’s Water Treatment Plants?
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理解水生环境中的微生物存活机制对公共卫生至关重要。本研究探讨了自由生活阿米巴（free-living amoebae, FLA）作为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）在伊斯坦布尔饮用水和污水处理厂中环境庇护所的潜在作用。研究于雨季（2024年
理解水生环境中的微生物存活机制对公共卫生至关重要。本研究探讨了自由生活阿米巴（free-living amoebae, FLA）作为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）在伊斯坦布尔饮用水和污水处理厂中环境庇护所的潜在作用。研究于雨季（2024年2月至3月）和旱季（2024年5月至6月）从不同设施的进水和出水点进行采样，并采用了标准化的水样采集、过滤、DNA提取和测序方案。宏基因组分析结果显示，盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）是唯一被检测到的FLA，并鉴定出螺杆菌属DNA片段，其中归属于H. pylori的平均比例为31.8%。鉴于D. discoideum主要是一种土壤栖息的社会性阿米巴，而非具有公共卫生意义的典型水生FLA，其在水处理系统中的检出可能反映了降水事件后的土壤径流，或采样及过滤过程中的环境污染。然而，用于评估细菌活性的定量PCR（qPCR）和叠氮碘化丙锭-微滴数字PCR（propidium monoazide–droplet digital PCR, PMA-ddPCR）对所有水样本均呈阴性结果。同样，无菌培养和显微镜分析未能分离出活的阿米巴。尽管宏基因组信号提示了微生物的既往存在，但缺乏活性生物体表明其可能因环境或处理相关因素而失活。本研究首次将PMA-ddPCR应用于H. pylori检测，对活细胞具有高特异性。研究结果凸显了仅依赖基于DNA的检测方法评估病原体活性和种间相互作用的关键局限性。尽管活H. pylori和FLA的检测结果为阴性，但本研究引发了关于水媒传播的担忧，并强调了整合活性检测技术的重要性。建议进行更广泛的采样和纵向监测，以全面评估阿米巴介导的存活及H. pylori等致病菌环境持续存在的风险。这些研究结果支持“同一健康”（One Health）方法，将环境微生物学与城市水系统中人类和动物健康风险管理联系起来。
**研究背景与目的**
微生物间的相互作用是其在不利环境条件下存活的关键机制之一。大多数微生物（包括胞内细菌）依赖宿主生存，已有假说认为部分细菌可利用阿米巴作为宿主。通常，这种相互作用始于阿米巴通过吞噬作用摄取细菌以供消化；然而，若细菌属于阿米巴抗性细菌（amoeba-resistant bacteria, ARB），则可逃避降解并在宿主细胞内持续存活。在水生环境中，具有公共卫生意义的自由生活阿米巴（free-living amoebae, FLA）包括棘阿米巴属（Acanthamoeba）和耐格里原虫属（Naegleria）等，而盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）是一种主要与土壤相关的社会性阿米巴（细胞黏菌），已被广泛用作研究阿米巴-细菌相互作用的模式生物。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是一种螺旋形革兰氏阴性菌，与Correa级联导致的胃癌、黏膜相关淋巴组织（mucosa-associated lymphoid tissue, MALT）淋巴瘤及胃外疾病相关。尽管其主要传播途径为粪-口途径，但证据表明H. pylori也可能通过污染水体传播。实验室和现场研究显示，H. pylori可在酵母和阿米巴等单细胞生物中存活，提示其可能利用这些宿主作为人体外的保护性生态位。嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）与阿米巴的相互作用已被充分研究，其通过操纵宿主细胞机制在阿米巴内建立特化复制生态位的模式，为本研究提供了概念模型。目前直接针对环境-动物-人类三元关系以及饮用水-废水-细菌-人类链条的现场研究十分有限。据此，研究人员开展了一项前瞻性研究（据文献报道为国际上同类研究中的第二项），旨在确定土耳其最大都市伊斯坦布尔饮用水和废水中FLA和H. pylori的存在情况，并调查两者之间是否存在潜在关联。
**研究开展与主要发现**
研究涵盖两个采样期以反映季节性降水差异：高降水期（2024年2月至3月）和较低降水期（2024年5月至6月）。水样采集自伊斯坦布尔供水和污水处理管理局（?SK?）运营的饮用水和废水处理厂，包括各处理系统的主进水（原水）和最终出水点，并在部分饮用水处理厂的臭氧化单元进、出口采集中间样本。每个采样点设置三个生物学重复，每两周采样一次，每次采集10升水样，在+4°C冷链条件下运输并于4小时内处理。样本经0.45 μm玻璃微纤维滤膜真空过滤浓缩后提取DNA。宏基因组分析显示，所有样本中细菌域相对丰度最高（27.54%±14.29），变形菌门（Proteobacteria）为主要门类（16.45%±10.98），而阿米巴门和包含H. pylori的ε-变形菌纲仅为痕量水平。所有阿米巴DNA序列均被归类为D. discoideum；归属于螺杆菌属的DNA序列中，平均31.80%（范围4.76%–75.74%）被鉴定为H. pylori，但绝对读数极低（通常<总读数的0.01%）。然而，qPCR和PMA-ddPCR对所有水样本均呈阴性，无菌培养和显微镜检查亦未检出活性阿米巴。该研究表明，基于DNA的检测信号与活性检测结果之间存在显著不一致。
**主要关键技术方法**
研究人员采用了多种互补技术：①宏基因组霰弹测序，使用Illumina NovaSeq 6000平台进行双端测序（2×150 bp），用于广谱筛查样本中所有DNA片段；②叠氮碘化丙锭-微滴数字PCR（PMA-ddPCR），利用PMA染料选择性结合游离DNA以排除死细胞信号，结合ddPCR实现活菌绝对定量，这是该技术首次应用于H. pylori检测，并以H. pylori ATCC 43504株为阳性对照验证方法可行性；③定量PCR（qPCR），靶向H. pylori的cagA基因区域以检测总DNA（包括死菌）；④阿米巴无菌培养，将样本接种于预先铺有活大肠杆菌K-12（ATCC 10798）的非营养琼脂（non-nutrient agar, NNA）平板上，于22–25°C暗处培养长达30天以评估阿米巴活性；⑤光学显微镜检查，包括微分干涉差（DIC）显微镜和荧光染色（吖啶橙、异硫氰酸荧光素FITC）以观察阿米巴形态特征。生物信息学分析使用FastQC、Trimmomatic和Kraken2（PlusPF数据库）进行物种分类。
**研究结果**
**3.1 宏基因组分析**：通过霰弹测序和Kraken2分类分析发现，所有水样本中细菌域相对丰度最高，变形菌门为主要门类；阿米巴门和ε-变形菌纲仅为痕量水平。所有被检出的阿米巴DNA序列均归属于D. discoideum，而非典型的公共卫生相关水生FLA属。在螺杆菌属DNA序列中，H. pylori占平均31.80%，但绝对读数极低，且因未设置测序阴性空白对照，这些痕量信号需谨慎解读。
**3.2 qPCR**：以H. pylori ATCC 43504株为阳性对照、无核酸酶蒸馏水为阴性对照，针对cagA基因区域对所有水样本进行qPCR筛查。结果显示所有样本均呈阴性，未检出H. pylori DNA。
**3.3 PMA-ddPCR**：阳性对照菌株产生阳性反应，阴性对照为阴性，确认该方法适用于靶向H. pylori检测。然而，所有环境水样本经PMA-ddPCR检测均呈阴性，表明样本中不存在具有完整膜结构的活H. pylori细胞。
**3.4 光学显微镜与无菌培养**：在NNA培养基上，以E. coli K-12为营养源进行30天培养，未观察到特征性的透明噬菌斑、细菌裂解区或阿米巴生长迹象，所有培养结果均为阴性。光学显微镜检查（包括DIC和荧光染色）未检出滋养体或包囊等阿米巴特异性形态特征，仅观察到非特异性的细菌碎片和有机颗粒。
**微生物群落多样性与分类学概述**：为验证测序深度并评估水处理系统的生态动态，研究人员进行了标准群落生态学分析。Shannon指数范围为4.38至7.55，表明样本具有较高的微生物丰富度和均匀度；基于Bray-Curtis相异度的多维尺度分析（Multi-Dimensional Scaling, MDS）揭示了不同样本间微生物群落的结构变异；层次聚类（平均链接法，Bray-Curtis指标）显示最丰富的30个分类群以典型的环境和水相关细菌属（如Acinetobacter、Pseudomonas、Aeromonas和Flavobacterium）为主导，有效表征了所采样处理厂的基础微生物群落。
**讨论与结论**
讨论部分指出，宏基因组分析检测到目标微生物的DNA片段，但PMA-ddPCR、qPCR、无菌培养和显微镜检查均未能确认其存在。这些痕量宏基因组信号最可能代表裸露的环境DNA、死亡细胞残余或测序伪影（如条形码渗漏），而非活跃的公共卫生威胁。由于缺乏测序空白、提取对照和试剂对照，且痕量读数（如单个读数）无法进行可靠的read级比对验证，这些发现需谨慎解读。研究局限性包括：无法在显微镜下直接证实阿米巴-H. pylori协同作用；受预算限制，每个采样点的前瞻性样本量有限；采样策略为靶向环境筛查而非对整个处理链的完整纵向评估；PMA处理的方法验证仅限于活性阳性对照，未包括热灭活和混合细胞对照。结论认为，在微生物活性是关键因素（如阿米巴-细菌相互作用）的情况下，仅依赖核酸检测可能导致误判，应结合能够评估微生物活性的补充方法。鉴于本研究发现来源于有限的采样，强烈建议开展更大样本量和更广泛应用领域的未来研究。在饮用水和废水中检测到遗传痕迹表明这些受纳环境可能已暴露于环境污染，研究人员认为结合传统和分子方法监测饮用水和废水有助于预防潜在的流行病和大流行病，并参照军团菌病模型，有必要以新的、大规模的前瞻性研究进一步阐明水与螺杆菌传播之间的关系。
