玻璃体视网膜淋巴瘤外周血MYD88 L265P检测的诊断价值评估

《Genes》：Diagnostic Utility of Peripheral Blood MYD88 L265P Testing in Vitreoretinal Lymphoma

　　

背景/目的：玻璃体视网膜淋巴瘤（vitreoretinal lymphoma, VRL）是一种罕见的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma）。对眼内液（房水或玻璃体液）进行MYD88突变的分子分析已成为VRL诊断的重要工具。本研究旨在评估外周血MYD88 L265P检测在VRL中的诊断价值及其与中枢神经系统（central nervous system, CNS）受累的关系。方法：纳入2021年3月至2024年3月期间疑似VRL的患者。所有患者在初次门诊就诊时采集房水样本，并在治疗前获取外周血样本。研究人员采用等位基因特异性实时聚合酶链反应（allele-specific real-time polymerase chain reaction, AS-qPCR）检测所有患者房水和外周血样本中MYD88（NM_002468.4）c.794T>C（p.L265P）突变的存在情况。VRL诊断基于临床表现并经玻璃体细胞病理学确认。若在本机构行玻璃体切除术，同时检测玻璃体液中MYD88 L265P突变。结果：共纳入12例VRL患者（男性8例，女性4例）。其中7例有CNS受累，4例在采样时正在接受全身化疗。房水中MYD88 L265P突变检出率为9/12（75.0%），玻璃体液中为8/9（88.9%）。所有血液样本均未检出该突变。结论：虽然房水和玻璃体液样本在VRL中对MYD88 L265P突变具有高检出率，但对全血提取的主要为白细胞来源的DNA进行等位基因特异性实时PCR分析并未检测到MYD88 L265P突变。这一发现支持了VRL（包括伴有CNS受累的病例）主要局限于免疫豁免部位的观点，即循环中无可检出的淋巴瘤细胞，因此无法通过常规外周血DNA分析获得有效的诊断信息。

研究背景与问题提出

玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）是最常见的眼部淋巴瘤，属于非霍奇金淋巴瘤的罕见亚型，可表现为原发性VRL或与中枢神经系统淋巴瘤（CNSL）相关。研究表明，50%至90%的原发性VRL患者会同时或后续发生CNSL，而15%至25%的原发性CNSL患者会发展为VRL。髓样分化初级反应基因88（MYD88）L265P突变是原发性CNSL（约60%病例）和原发性VRL（约87%病例）中最常见的突变之一。既往研究已证实，对VRL患者的房水和玻璃体液液体活检进行MYD88突变分析具有诊断和疾病监测价值。此外，即使在没有临床明显CNS受累的情况下，VRL患者的脑脊液（CSF）游离DNA（cfDNA）中也可检测到MYD88突变。近年来，血浆循环肿瘤DNA（ctDNA）分析提供了一种微创方法来检测原发性CNSL患者的MYD88突变，反映了循环中存在肿瘤来源的DNA片段。然而，对外周血白细胞来源的细胞DNA进行分析则解决了一个不同的生物学问题——即携带突变的淋巴瘤细胞是否存在于外周循环中。鉴于对微创分子检测日益增长的兴趣，研究人员开展了本研究，旨在评估采用常规临床检测方法（对全血提取的主要为白细胞来源的细胞DNA进行分析）进行的外周血MYD88 L265P检测在VRL患者以及伴有CNS受累患者中是否具有诊断价值。该研究未涉及血浆或血清cfDNA分析，因为当时尚未建立经过验证的血液相关cfDNA提取/处理方案。

主要关键技术方法

研究人员前瞻性地在美国密歇根大学Kellogg眼科中心开展研究，经机构审查委员会批准并遵循赫尔辛基宣言原则。纳入2021年3月至2024年3月期间疑似VRL的患者。所有患者在初次门诊就诊时采集约0.2mL房水样本；若在本机构行玻璃体切除术，则在手术开始时收集约1至1.5mL未稀释玻璃体液。所有患者在治疗前采集EDTA抗凝外周血样本。采用Zymo Research Quick-DNA尿液试剂盒从眼内液中提取细胞和游离DNA（cfDNA），并使用Qiagen BioRobot EZ1 Advanced系统从全血中进行自动化DNA提取（主要获得白细胞来源的细胞DNA）。所有样本均在密歇根大学分子诊断实验室通过等位基因特异性实时聚合酶链反应（AS-qPCR）检测MYD88（NM_002468.4）c.794T>C（p.L265P）突变。该检测方法的检测阈值设定为1%突变等位基因频率，控制Ct值≤30周期作为结果充分的判定标准。排除既往有Waldenstr?m巨球蛋白血症和/或IgM单克隆丙种球蛋白病意义未明病史的患者。

研究结果

3.1 眼内液样本中MYD88 L265P突变的检测

通过对12例患者的房水和/或玻璃体液样本进行分析，共计9例患者（75.0%；95%置信区间CI，46.8%至91.1%）检测到MYD88 L265P突变阳性。具体而言，房水样本中突变检出率为9/12（75.0%；95%CI，46.8%至91.1%），玻璃体液样本中为8/9（88.9%；95%CI，56.5%至98.0%）。在20份房水样本中，有6份（来自5例患者）被判定为结果不充分；其中4例患者的对侧眼房水结果充分，3例阳性、1例阴性；1例患者双眼房水结果均不充分且无玻璃体液样本可用。所有玻璃体液样本均获得充分结果。当分析仅限于至少有一份充分房水结果的患者时，MYD88 L265P检出率为9/11（81.8%；95%CI，52.3%至94.9%）。在3例眼内液样本未检出MYD88 L265P的患者中，1例临床诊断为疑似VRL，2例为伴有眼部受累的原发性CNSL。在有CNS受累史或现病史的7例患者中，5例（71.4%；95%CI，35.9%至91.8%）眼内液样本中检出MYD88 L265P突变，1例检测结果为阴性，1例房水结果不充分且无玻璃体液样本可用。在眼内液结果充分的患者中，有CNS受累者与无CNS受累者的MYD88 L265P检出率分别为83.3%（5/6）和80.0%（4/5）（Fisher精确检验，p=1.000）。在12只同时具有房水和玻璃体液样本的眼睛中，排除不充分结果后，所有9只眼睛的两种样本分析结果一致（100%；95%CI，70.1%至100%），其中8只眼睛两种样本均为阳性，1只眼睛均为阴性。

3.2 外周血中MYD88 L265P突变的检测

所有12例患者的全血样本均未检测到MYD88 L265P突变（0%；95%CI，0%至24.3%），且所有外周血样本均获得充分结果。

讨论部分总结

本研究发现，尽管VRL患者房水和玻璃体液样本中MYD88 L265P突变检出率较高（分别为75.0%和88.9%），但对外周血样本中主要白细胞来源的细胞DNA进行实时PCR分析却未能检测到该突变。这表明，虽然MYD88 L265P是眼内液中有价值的生物标志物，但在外周血样本中检测该突变仍具挑战性，尤其是采用常规全血DNA提取和分析方法时。既往研究报告VRL患者房水中MYD88 L265P突变检出率为67%至75%，玻璃体液中为75%至89%，配对样本间一致性高，本研究结果与此相符。据研究人员所知，这是首项探讨VRL患者全血中主要白细胞来源细胞DNA中MYD88 L265P突变的研究。此前，CSF来源的cfDNA已在VRL患者中得到研究，而CSF和血浆来源的cfDNA也已在原发性CNSL患者中被评估为潜在诊断工具。在原发性CNSL患者中，血浆cfDNA浓度低于系统性淋巴瘤患者，血浆中MYD88突变的检出率因分析方法不同而异，范围为0%至57%。本研究中外周血检出率为0%，表明在当前检测灵敏度（1%变异等位基因频率检测阈值）下，通过检测主要白细胞来源的细胞DNA无法检出MYD88 L265P突变。结合眼内液的高检出率，这一发现支持VRL和CNSL的区室化生物学特性，即携带突变的淋巴瘤细胞可能难以进入外周循环。然而，低频率变异（低于1%）可能无法通过该方法检测到，因此研究结果无法区分是真正缺乏循环中携带突变的细胞，还是这些细胞水平低于检测限。值得注意的是，阴性全血MYD88 L265P检测结果不能排除VRL。由于本研究未采用血浆或血清cfDNA分离方法，且常规全血程序无法有效捕获cfDNA，因此这些发现并不排除使用更敏感方法对VRL患者进行血浆或血清cfDNA分析的潜在诊断价值。研究局限性包括：仅分析了白细胞来源的细胞DNA而非血浆/血清cfDNA；未进行CSF来源的cfDNA分析；样本量有限且为横断面设计；未进行CD19阳性B细胞富集。

研究结论翻译

我们的结果对VRL患者的管理具有重要意义。我们的发现进一步支持了眼内液液体活检检测MYD88 L265P突变作为一种敏感的诊断工具。另一方面，我们的数据显示，基于常规全血处理主要白细胞来源细胞DNA的分析，采用1%变异等位基因频率检测阈值的检测方法所获得的阴性外周血检测结果，不应被解释为疾病不存在的确凿证据。这些发现仅适用于我们所采用的检测方法，并不涉及血浆/血清cfDNA分析或更敏感的方法如数字PCR或下一代测序技术。因此，对于怀疑患有VRL（无论是否伴有CNS受累）的患者，临床医生应继续优先考虑眼内液检测，以及在临床指征明确时进行CSF检测，以寻找MYD88 L265P突变作为诊断工具。由于这是首项探讨VRL患者外周血阳性率的研究，我们的发现为不断增长的研究提供了有价值的数据，但也表明需要通过采用血浆/血清cfDNA分析、更敏感的方法和/或在更大患者队列中进行纵向监测来进一步开展研究，以增进我们对VRL中微创血液突变分析潜在应用价值的认识。