《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Integrated internal standard volumetric dried blood microsampling for the quantification of phosphatidylethanol 16:0/18:1
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磷脂酰乙醇16:0/18:1（PEth）是酒精消费的直接生物标志物，在乙醇存在下于红细胞膜中形成。20 ng/mL和200 ng/mL的浓度已被提议作为区分戒酒或低水平饮酒与中度饮酒及指示酒精滥用的临界值。鉴于PEth在液体全血中稳定性有限，干血斑（DBS）被
磷脂酰乙醇16:0/18:1（PEth）是酒精消费的直接生物标志物，在乙醇存在下于红细胞膜中形成。20 ng/mL和200 ng/mL的浓度已被提议作为区分戒酒或低水平饮酒与中度饮酒及指示酒精滥用的临界值。鉴于PEth在液体全血中稳定性有限，干血斑（DBS）被认为是PEth测定的优选基质。然而，常规DBS工作流程可能损害定量准确性，因为内标无法完全补偿与提取相关的变异性。在本研究中，研究人员考察了将同位素标记内标（d5-PEth）直接整合入Capitainer?B10 Vanadate卡样本圆片的策略。研究人员开发了一种基于选择反应监测（SRM）的快速UHPLC-MS/MS方法，总运行时间为5分钟，并配套建立了适用于常规应用的提取方案。该方法在校准性能、灵敏度、准确度、精密度、基质效应和提取回收率方面均得到验证。检出限为4.2 ng/mL，观察到中度离子抑制，提取回收率为57±18%。所建立的集成内标定量干血斑（iqDBS）工作流程在三个分析批次共48个加标样本中表现出满意的重复性，变异系数（CV%）低于15%。在高温加速老化条件下，装置在制备后长达2.5个月内稳定性得到确认。总体而言，所提出的iqDBS策略为PEth定量提供了稳健且有前景的框架，提升了酒精生物标志物评估在临床和法医应用中的可靠性。
**论文解读：集成内标容积式干血微采样（iqDBS）定量磷脂酰乙醇16:0/18:1的方法研究**
**一、研究背景与现存问题**
磷脂酰乙醇16:0/18:1（PEth）是乙醇存在的条件下，经磷脂酶D（PLD）催化转磷脂酰化反应在红细胞膜上形成的异常磷脂，其形成与酒精摄入直接且特异相关，是反映近期及慢性酒精消费的高特异性直接生物标志物，检测窗口长达4周。在已鉴定的48种PEth同系物中，PEth 16:0/18:1丰度最高，占PEth总量的37–46%。以PEth 16:0/18:1全血浓度20 ng/mL和200 ng/mL为阈值，可分别区分戒酒或低水平饮酒与中度饮酒，以及指示慢性过量饮酒。PEth检测已广泛用于临床决策支持，包括移植前评估、孕期饮酒评估、新生儿酒精暴露检测及戒酒依从性监测等。
干血斑（DBS）采样的优势已在多项研究中被证实，尤其适合PEth分析，因为PEth在液态全血中稳定性有限，而在DBS基质中至少在–20、4和18°C条件下可稳定储存≥60天。然而，常规DBS是非容积性的，存在血细胞比容效应等固有局限性。采用Capitainer?B10微采样装置可借助微流控通道定量采集固定体积的全血，实现真正的容积式微采样。Capitainer?B10 Vanadate卡片还在滤纸中整合了偏钒酸钠，作为PLD抑制剂防止采血后残余乙醇诱导的PEth生成。
一个关键的、尚未充分解决的问题是内标（ISTD）的引入方式。在常规LC-MS/MS分析中，内标直接加入液态样品并与分析物均匀混合，可补偿全分析流程中的变异性；但在常规DBS中，分析物被固封于干燥基质内，内标通常仅在提取阶段加入，二者在时间和空间上的分离削弱了内标对提取效率及储存相关变异（尤其受湿度、温度等环境条件影响）的补偿能力。现有探索性研究虽尝试将内标预涂覆于采样卡上，但尚需系统验证。本研究旨在研发一种将同位素标记内标直接整合入采样基质的新型平台——集成内标定量干血斑（iqDBS）系统，即（d5-PEth）被直接整合入经改装的Capitainer?B10装置样本圆片中，使分析物和内标在采血时即发生即时接触。这是首次将同位素标记PEth内标直接整合入含偏钒酸钠的容积式DBS采样装置的研究。
**二、研究内容与技术方法**
研究人员设计并验证了iqDBS工作流程：先将偏钒酸钠和d5-PEth依次施加于Capitainer?B10 Vanadate卡的样本圆片上，干燥后用于全血样本采集，随后经超声辅助提取、氮吹浓缩和甲醇复溶，结合UHPLC-MS/MS（选择反应监测SRM模式，总运行时间5分钟）进行定量分析。在方法开发阶段，研究人员系统比较了三种内标整合策略（采血前预点样于滤纸、采血前加标于液态全血、采血后点样于干血斑）与常规提取时加入内标方式的定量一致性；优化了提取流程各参数；考察了全血与替代基质（含2% w/v牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）对d5-PEth提取效率的影响；评估了偏钒酸钠和内标溶液添加体积对装置微流控采样性能的潜在干扰。方法验证遵循FDA生物分析方法验证指南，在三个独立分析批次中考察了校准模型、检出限（LOD）和定量限（LOQ）、日内日间准确度与精密度、基质效应（ME%）和提取回收率（ER%）。稳定性评估采用加速老化方案（70°C储存，对应室温约2.5个月）。样本来源方面，空白全血由BioIVT提供（供者报告采血前60天内无饮酒），PEth阳性混合全血购自LifeSouth（佛罗里达州盖恩斯维尔）；血液样本均采集于K2EDTA管中。
**三、主要研究结果**
*内标整合方式的三种方法比较*：在标准加入法框架下，预点样（Pre-Spot）方式在有无内标归一化两种计算路径间表现出最高的一致性；预加标（Pre-Fortification）方式因内标在液态血液中匀化不充分（d5-PEth峰面积CV=52%），导致两种定量结果偏差最大；后点样（Post-Spot）结果可比但变异性较大；常规工作流程在无内标归一化时呈现系统性高估。预点样方式在四个PEth浓度水平上分析物/内标峰面积比的平均CV%最低（3%），提示该方法可能对储存及前处理阶段分析物潜在损失提供最有效的补偿。
*预冲孔样本圆片上的内标整合评估*：基于48个加标样本（每浓度4个复本×4个浓度×3个分析批次），d5-PEth提取的CV%在各批次内为11–14%，批次间为14–15%，均低于FDA指南规定的15%验收标准，证实内标整合和提取流程具有良好的重复性。
*滤纸内标提取——血液与替代基质比较*：使用2% w/v BSA-PBS替代基质制备的iqDBS样本与全血iqDBS样本相比，d5-PEth提取效率存在统计学显著差异（p=3.23×10?3）。以替代基质构建校准曲线定量同一混合全血样本的PEth浓度为211 ng/mL，而全血基质标准加入法测得的浓度为65.0 ng/mL，二者差异显著，表明所试替代基质不适用于本方法体系的准确PEth定量。
*内标整合入微采样装置后的比较*：分散式Ahlstrom 222圆片与Capitainer?B10卡片的校准曲线对比显示，装置卡片的内标提取CV%较高（21% vs 10%）。交叉验证中，匹配提取与校准基质的定量结果高度一致（190与198 ng/mL），而跨基质定量偏差较大，提示校准材料制备存在系统偏差。将偏钒酸钠施加体积由2.0 μL优化至1.0 μL后，d5-PEth提取CV%降至8%。在四种实验条件（含偏钒酸钠、以氯化钠替代偏钒酸钠、仅含内标、常规后加内标）下对同一真实全血样本定量，PEth浓度范围为165–192 ng/mL，CV=7%，表明内标及盐溶液的预整合未对装置的容积采样和PEth定量产生实质性影响。
*iqDBS方法验证*：在10.0–500 ng/mL范围内校准模型为线性且方差非齐性，故采用1/x2加权线性回归。Hubaux-Vos算法计算的LOD为4.20 ng/mL，并通过实验验证。LOQ确定为10.0 ng/mL。所有浓度水平的日内与日间Bias%和CV%均在±15%验收限内，其中20.0和200 ng/mL临床决策阈值水平表现尤为稳定。ME%评估显示低浓度处有轻微离子增强，中高浓度处有中等离子抑制；ER%为57±18%，属DBS方法可预期范围。三个验证批次间内标提取CV%为12–15%，Student's t检验显示日间无统计学显著差异。
*iqDBS装置的稳定性*：经70°C加速老化5天（相当于室温储存约2.5个月），低（10.0 ng/mL）和高（300 ng/mL）质控水平的PEth/内标峰面积比无显著变化（单因素ANOVA p>0.05），24个样本的内标峰面积CV%为12%，PEth定量结果均在标示浓度的±15%以内，证实装置在密封铝箔包装下于该时间段内保持功能完好。
**四、总结与讨论**
本研究首次将同位素标记内标d5-PEth直接整合入含偏钒酸钠的容积式DBS采样装置（Capitainer?B10 Vanadate）中，建立了面向PEth 16:0/18:1定量的iqDBS工作流程。该策略使分析物与内标在采血即刻同处一个基质环境并经历共同的提取流程，从而在原理上弥补了常规DBS中内标在时间和空间上与分析物分离的固有缺陷。
讨论部分指出，DBS微采样虽在分析物稳定性和前处理便捷性方面优势显著，但在涉及法律或临床后果的场景（如器官移植资格评估、儿童监护权诉讼、驾照恢复）中，定量结果的可靠性和可追溯性至关重要。常规内标引入方式无法补偿DBS样本在运输和储存期间目标分析物的波动，而iqDBS的预整合模式从采血初始阶段即建立分析物与内标的接触，并实现共提取。
关于基质效应评估，研究特别强调，在iqDBS范式中，由于内标预整合于滤纸上，其本身也可能受离子抑制/增强影响，且其响应可能随目标分析物浓度变化，进而在计算分析物/内标比值时影响表观ME值。尽管部分浓度水平的ME%略超出常规80–120%区间，但全程准确度和精密度仍然符合验收标准，故该方法的基质效应特征应结合其集成内标特性加以解释。
研究结论明确指出，所开发的iqDBS方法在校准模型、灵敏度、精密度和准确度方面均获得可靠的验证数据，装置在加速老化条件下的稳定性进一步支持其实际应用潜力。该方法为PEth定量建立了新型分析框架，有望提升酒精生物标志物评估在临床和法医背景下的可靠性。未来的工作将重点包括：在更大规模的真实临床和法医样本队列中进行方法性能表征、开展实时稳定性研究以确证装置的长期保存期限、扩展至其他PEth同系物（如PEth 16:0/18:2）的分析，以及将真实样本的微采样结果与静脉血点样结果进行偏倚比较。
