《Applied and Environmental Microbiology》：Identification and characterization of the hydratase ThnL preparing for the second-ring cleavage in anaerobic naphthalene degradation
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多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的厌氧降解经由辅酶A（CoA）活化的中间产物和类β-氧化反应进行；然而，负责关键水合与水解步骤的酶仍未被充分阐明。在硫酸盐还原富集培养物N47中，thn操纵子编
摘要专业翻译
多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的厌氧降解经由辅酶A（CoA）活化的中间产物和类β-氧化反应进行；然而，负责关键水合与水解步骤的酶仍未被充分阐明。在硫酸盐还原富集培养物N47中，thn操纵子编码多个推定参与厌氧萘降解的水合酶和水解酶。本研究克隆、异源表达并纯化了六个候选酶（ThnA、ThnH、ThnI、ThnL、ThnM和ThnU），以阐明其底物特异性。其中，ThnL对2-羧基环己基亚甲基乙酰-CoA（2-carboxycyclohexylideneacetyl-CoA）表现出强催化活性，催化烯酰-CoA双键的快速水合，生成叔醇1-（1-羟基-2-羧基环己基）乙酰-CoA（1-(1-hydroxy-2-carboxycyclohexyl)acetyl-CoA）。ThnL的动力学参数为Km = 0.11 mM，Vmax = 350 μmol min?1 mg?1。另外两种水合酶ThnU和ThnI对该底物的转化活性极弱（分别为ThnL活性的0.26%和0.08%），表明其发挥的是混杂性而非生理性功能。ThnL还催化2-氧代环己烷-1-羰基-CoA（2-oxocyclohexane-1-carbonyl-CoA）的C1–C2水解性开环，生成庚二酰-CoA（pimelyl-CoA），揭示其具有水合酶/水解酶双功能活性；然而基于生长实验，该反应不太可能具有生理相关性。本研究表明，ThnL催化的2-羧基环己基亚甲基乙酰-CoA水合生成叔醇1-（1-羟基-2-羧基环己基）乙酰-CoA，完成了厌氧萘降解中第二环裂解之前的最后准备步骤。
论文解读
一、研究背景与科学问题
多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）如萘，是广泛存在的环境污染物，来源于自然和人为活动。由于其疏水性和难降解性，PAHs对环境修复构成重大挑战。在无分子氧条件下，单环和稠环芳香烃通常被活化并转化为辅酶A（CoA）硫酯，随后经还原性脱芳构化和一系列类β-氧化反应进行代谢，包括剩余双键的水合、脱氢和水解性开环，最终生成脂肪族酰基-CoA衍生物。因此，水合酶和水解酶是芳香族化合物厌氧降解中的关键酶。
尽管萘的好氧降解已被广泛研究，但其厌氧降解途径的酶学机制仍知之甚少。基因组和代谢物研究表明，萘和菲降解中的开环途径也经由类β-氧化反应进行，但编码厌氧萘代谢中水合酶和水解酶的具体基因尚未被完全鉴定。在前期研究中，硫酸盐还原富集培养物N47基因组中的thn基因簇被证实编码参与萘厌氧降解的酶。thn操纵子编码七个推定的水合酶/水解酶，包括crotonase样水合酶（ThnA、ThnL、ThnM和ThnU）、MaoC样脱水酶（ThnH和ThnI）以及金属依赖性水解酶（ThnN），它们可能参与萘厌氧降解的下游途径。然而，这些候选酶的具体催化功能和生理底物尚不清楚，特别是第二环裂解前的水合步骤一直缺乏实验验证。因此，研究人员开展了本研究，旨在鉴定催化关键水合反应的酶并阐明其功能。
二、研究内容与主要结论
研究人员克隆并在Escherichia coli中异源表达了thn操纵子中推定编码水合酶/水解酶的七个基因，纯化了相应的重组蛋白，并通过体外酶活测定、动力学分析和系统发育分析等手段阐明了各候选酶的底物特异性和催化功能。研究结果表明，ThnL是催化2-羧基环己基亚甲基乙酰-CoA水合生成叔醇1-（1-羟基-2-羧基环己基）乙酰-CoA的特异性水合酶，该反应是厌氧萘降解中第二环裂解之前的最后准备步骤。此外，ThnL还表现出对2-氧代环己烷-1-羰基-CoA的水解性开环活性，但该活性极弱且不具有生理相关性。
三、关键技术与方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：从硫酸盐还原富集培养物N47中提取基因组DNA并扩增目标基因，构建重组表达质粒并在E. coli中异源表达；通过亲和层析纯化重组蛋白，利用SDS-PAGE和凝胶过滤层析分析蛋白纯度及寡聚状态；采用化学合成和酶促合成方法制备CoA硫酯底物，包括利用CoA转移酶ThnP和酰基-CoA脱氢酶ThnO酶促合成2-羧基环己基亚甲基乙酰-CoA；通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术监测底物转化和产物生成；利用Michaelis-Menten动力学分析测定酶动力学参数；通过序列比对、邻接法系统发育分析和AlphaFold结构建模进行进化与结构分析。样本来源为硫酸盐还原富集培养物N47，以萘为唯一碳源和电子源、硫酸盐为电子受体进行厌氧培养。
四、研究结果
重组蛋白的生产与大小表征
thn操纵子中推定编码水合酶或水解酶的七个基因在E. coli中表达。除ThnN以不可溶形式产生外，所有带有His6或Twin-strep标签的重组蛋白均以可溶酶形式获得并纯化至均一。SDS-PAGE分析显示蛋白条带与预测的单体分子质量一致，ThnA、ThnH、ThnI、ThnL、ThnM和ThnU的分子质量分别为30.0、17.7、17.4、29.3、32.6和31.3 kDa。凝胶过滤层析显示ThnL天然蛋白的表观分子质量约为93 kDa，表明其在溶液中可能形成同源三聚体组装，这与crotonase超家族成员通常以三聚体或六聚体形式存在的报道一致。
重组酶对2-羧基环己基亚甲基乙酰-CoA的转化
在六个纯化的重组候选酶中，仅ThnL对2-羧基环己基亚甲基乙酰-CoA表现出显著的催化活性，ThnI和ThnU仅检测到微量产物生成。底物（保留时间8.6 min，m/z 934）与产物（保留时间7.3 min，m/z 952）之间的质量差为+18，表明侧链双键发生了水合反应，最可能生成叔醇1-（1-羟基-2-羧基环己基）乙酰-CoA。当加入4 μg/mL ThnL至60 μM底物时，3分钟内93%的底物被转化，对应比活力为4.7 μmol min?1 mg?1。ThnL对该底物的动力学参数为Km = 0.11 mM，Vmax = 350 μmol min?1 mg?1。相比之下，ThnU和ThnI的比活力分别仅为0.012和0.004 μmol min?1 mg?1，分别为ThnL活性的0.26%和0.08%，表明它们是混杂性烯酰-CoA水合酶。ThnL未能实现完全底物转化，转化率约96%，这可能与烯酰-CoA水合酶催化的可逆水合/脱水反应达到化学平衡有关。
重组酶对六氢-2-萘甲酰-CoA的转化
研究人员利用N47细胞提取物生物合成了六氢-2-萘甲酰-CoA（hexahydro-2-naphthoyl-CoA，HHN-CoA，m/z 928）并作为底物进行酶活测定。然而，六个测试酶均未显示出可检测的活性，既未观察到预期产物，也未观察到任何额外产物峰。
重组酶对2-氧代环己烷-1-羰基-CoA的转化
ThnL也是六个候选酶中唯一能催化2-氧代环己烷-1-羰基-CoA（m/z 892，保留时间11.1 min）转化的酶，180分钟内实现36%的底物转化，比活力为0.003 μmol min?1 mg?1。产物峰与合成的庚二酰-CoA标准品（m/z 910，保留时间9.5 min）一致，表明该反应涉及C1-C2键的水解性开环，生成庚二酰-CoA。因此，ThnL不仅是水合酶，还是具有水合酶和水解酶活性的双功能酶。然而，由于该水解酶比活力极低，其在厌氧萘降解中是否具有生理功能尚不明确。
细胞提取物对底物的转化
以萘为碳源生长的N47细胞提取物以0.056 μmol min?1 mg?1蛋白的速率消耗2-羧基环己基亚甲基乙酰-CoA，证实该反应确实在N47细胞中发生。在该测定条件下仅积累水合产物，未观察到下游代谢物，表明测得的比活力仅代表提取物中的水合酶反应。此外，当以2-氧代环己烷-1-羧酸作为N47菌株的唯一碳源和电子源时，2个月内未观察到显著微生物生长，表明尽管ThnL在体外对2-氧代环己烷-1-羰基-CoA具有微弱转化能力，该转化不太可能作为N47厌氧萘降解途径中的生理相关步骤发生。
五、讨论与结论
系统发育分析显示，ThnA、ThnL、ThnM和ThnU与严格厌氧菌Clostridium acetobutylicum和Syntrophomonas wolfei的巴豆酰-CoA水合酶具有39%–47%的高序列同一性。ThnA与Rhodopseudomonas型单烯酰-CoA水合酶聚类，而ThnL与Thauera/Geobacter/Magnetospirillum型二烯酰-CoA水合酶关系更近，但ThnL在本研究中未对二烯酰-CoA化合物六氢-2-萘甲酰-CoA表现出水合活性。ThnM和ThnU属于bbsH分支的crotonase样酶。ThnH和ThnI未与巴豆酰-CoA水合酶聚类，而是与MaoC样脱水酶聚在一起，提示ThnHI可能催化萘降解途径中迄今未鉴定的反应。
活性位点分析表明，thn操纵子内crotonase样水合酶（ThnA、ThnL、ThnM和ThnU）的氧阴离子洞关键残基保守。然而，ThnL中典型的通用碱基催化谷氨酸残基被甘氨酸（Gly114）替代，仅保留了一个催化谷氨酸（Glu134）。这种缺失通用碱基谷氨酸的情况在Pseudomonas aeruginosa的异己烯基戊二酰-CoA水合酶AtuE中已有报道。在Pseudomonas putida的甲基戊二酰-CoA水合酶LiuC中，底物的游离羧基被假设可功能性地替代缺失的通用碱基谷氨酸来激活水。ThnL的生理底物1-（1-羟基-2-羧基环己基）乙酰-CoA也含有游离羧基，可能以类似方式参与水激活。这解释了ThnL为何对缺乏游离羧基的六氢-2-萘甲酰-CoA无活性。相比之下，ThnA、ThnM和ThnU在活性位点拥有两个谷氨酸催化残基，可能特异性催化缺乏额外羧基的底物（如六氢-2-萘甲酰-CoA和β-氧代八氢-2-萘甲酰-CoA）的水合反应。
关于第二环裂解机制，研究人员此前提出了两种可能的开环策略：一种为LiuE样途径，涉及CoA转移和裂解酶反应，释放乙酸并生成2-氧代环己烷羧基-CoA；另一种为AtuA样醛缩酶介导的开环机制，在1-（1-羟基-2-羧基环己基）乙酰-CoA的环己烷环C1和C2之间断裂。由于N47细胞不能以2-氧代环己烷-1-羧酸为唯一碳源生长，LiuE样途径不太可能是N47细胞中实际或优选的裂解途径。研究结果支持AtuA样醛缩酶介导的开环机制更为合理。在此背景下，ThnL催化的2-羧基环己基亚甲基乙酰-CoA水合反应为厌氧萘降解中的第二环裂解反应提供了最后的准备步骤。
综上所述，本研究鉴定并表征了thn操纵子编码的双功能烯酰-CoA水合酶/酰基-CoA水解酶ThnL，证实其催化2-羧基环己基亚甲基乙酰-CoA的水合反应，生成叔醇1-（1-羟基-2-羧基环己基）乙酰-CoA，完成了厌氧萘降解中第二环裂解之前的最后准备步骤。该发现阐明了厌氧萘代谢中一个关键的准备步骤，推进了对缺氧环境中微生物PAHs降解的理解。
