硫源驱动的燃料生物脱硫菌Rhodococcus qingshengii IGTS8基因表达全局重塑

《Applied and Environmental Microbiology》：Sulfur source-driven global remodeling of gene expression in the fuel-biodesulfurizing Rhodococcus qingshengii IGTS8

　　

最近的蛋白质组学和代谢组学研究已确认，在脱硫4S途径之外，从全局尺度理解燃料生物脱硫表型具有重要意义。为揭示模式菌株Rhodococcus qingshengii IGTS8在生物脱硫条件下的转录组适应，研究人员开展了一项时间序列比较RNA-seq研究，使用分别以二苯并噻吩（dibenzothiophene, DBT）或MgSO₄为硫源培养的IGTS8菌株。RNA-seq数据揭示了大量随硫源和生长期变化的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），最强的转录组响应出现在对数后期。共检测到6,690个转录本，占全部蛋白编码基因的99.5%。DEGs中相当一部分编码ABC型转运蛋白和假定蛋白。在DBT培养物中，623个DEGs上调，587个DEGs下调。总体上，DEGs覆盖关键生理过程，如应激反应、基因表达调控、营养摄取、脂质、氨基酸、碳水化合物、蛋白质、核苷酸代谢、细胞分裂以及细胞壁合成/降解。在DBT培养物中，碳水化合物代谢基因大多下调，而编码氨基酸和脂肪酸降解以及能量保存的基因上调。此外，编码可移动遗传元件、C1代谢酶、碳酸酐酶和腈水合酶的基因在生物脱硫条件下上调。相反，二氢叶酸还原酶强烈下调。生物脱硫条件下依赖于生长期的转录组重排似乎优先考虑细胞稳态和保护而非增殖。

**生物脱硫环境中Rhodococcus qingshengii IGTS8的全局转录组重塑：多层级适应与应激优先策略**

**研究背景与意义**
化石燃料中的有机硫化合物（如二苯并噻吩及其烷基衍生物）燃烧后释放对环境有害的二氧化硫，并威胁公众健康，因此环保法规要求大幅降低运输燃料的硫含量。传统加氢脱硫工艺存在经济、技术和环境方面的不足，而微生物生物脱硫通过4S途径特异性利用燃料中的噻吩类化合物作为硫源，被认为是一种绿色替代方案。然而，经过数十年研发，脱硫催化活性低仍阻碍其商业化应用。已有研究表明，除4S途径外，菌株的生理和代谢特性也显著影响脱硫活性，但人们对脱硫表型的全面理解仍然缺乏。近期对该模式菌株的比较蛋白质组学和代谢组学研究揭示了除4S途径外的广泛细胞重塑，但转录层面的调控机制尚不清楚。为此，研究人员对Rhodococcus qingshengii IGTS8在生物脱硫条件（以DBT为硫源）与无机硫源（MgSO₄）下的转录组进行了时间序列比较，以揭示脱硫相关生理代谢响应的转录调控基础，为理性设计高效重组脱硫菌提供机制层面的依据。

**研究内容与总体结论**
研究人员在化学限定培养基中分别以DBT或MgSO₄为唯一硫源培养IGTS8，并在早对数期、中对数期、晚对数期和稳定期收获菌体，开展RNA-seq分析。结果共检测到6,690个转录本，覆盖99.5%的蛋白编码基因。以MgSO₄培养为对照，DBT培养中共有623个DEGs上调、587个DEGs下调，其中许多编码假定蛋白和ABC型转运蛋白。转录组响应在晚对数期最强，且重排方向总体指向细胞稳态维持、资源保存和应激保护，而非促进增殖。该研究与已报道的蛋白质组、代谢组数据整合，揭示了生物脱硫表型的多层级调控机制，为合成生物学改造提供了候选基因靶点。

**主要技术与方法**
研究使用R. qingshengii IGTS8（ATCC 53968），在含葡萄糖和乙醇为碳源、以DBT或MgSO₄为硫源的CDM培养基中培养，四个生物学重复，四个采样时间点。采用TRIzol法提取总RNA并去除基因组DNA，利用Tecan试剂盒和定制rRNA去除探针构建文库，在Illumina NextSeq2000平台进行单端100 bp测序。原始读数经Trimmomatic v0.38.0修剪，用Kallisto定量映射至IGTS8编码序列，通过DESeq2分析差异表达，显著阈值设为log₂ fold change ≥2或≤?2且P≤0.05。随机选择16个基因进行RT-qPCR验证，结果与RNA-seq一致。功能分类和富集分析借助BLAST、KEGG Mapper、Gene Ontology及DAVID工具完成。

**研究结果**

*转录组概览*
在DBT与MgSO₄培养中检测到的6,690个转录本占蛋白编码基因的99.5%。主成分分析显示，晚对数期两培养条件间转录组差异最大。维恩图表明仅1%的上调DEGs在所有生长期共有，而4.6%的下调DEGs被四个生长期共享；晚对数期独有的DEGs数量最多。

*生物脱硫条件下的硫代谢*
4S途径基因（pIGTS8_peg6351-pIGTS8_peg6353）自早对数期起在DBT培养中持续显著上调（log₂ fold change 2.34～6.5），稳定期显著下降。多种参与替代硫源摄取利用的ABC转运蛋白、硫酸酯酶和加氧酶基因在DBT培养中过表达（除稳定期外）。硫酸盐活化还原基因在稳定期下调。亚硫酸盐氧化还原酶、硫酸腺苷转移酶/APS激酶复合体及磺基转移酶基因在某些生长期上调。甲硫氨酸合成基因metY和metE也表现阶段特异性上调。

*生物脱硫相关的碳代谢*
大多数碳水化合物和中心代谢基因在DBT培养中下调或无显著差异。例外的是异柠檬酸裂解酶基因（IGTS8_peg5905）在中期显著上调，与乙醛酸支路激活一致。肌醇磷酸代谢基因簇（IGTS8_peg782-789）及其上游潜在肌醇转运子（IGTS8_peg800-802）在所有生长期强烈下调。碳酸酐酶基因（IGTS8_peg997、IGTS8_peg5020）分别在早期和晚对数期上调。C1代谢相关MoxR/CoxE/ThcE操纵子（IGTS8_peg6110-6112）和非显著变化的CO脱氢酶操纵子中IGTS8_peg4820在晚对数期上调。

*DBT培养刺激氨基酸降解*
谷氨酸合酶大、小亚基基因在不同生长期差异表达。缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、脯氨酸降解基因在DBT培养中显著上调。肌氨酸氧化酶转录本在早期和中期富集，甘氨酸脱氢酶基因（IGTS8_peg1817）在晚对数期过表达。尿素酶基因簇（IGTS8_peg342-348）在晚对数期上调，而尿素ABC转运蛋白基因下调。腈水合酶α/β亚基基因（IGTS8_peg4868、IGTS8_peg4869）及其上游酰胺酶基因显著上调，下游金属伴侣基因也协同上调；IGTS8能以乙腈为唯一碳源生长，证实了腈水合酶活性。

*脂质和脂肪酸代谢重塑*
大多数脂质代谢基因无显著差异，但部分例外：丙二酰-CoA ACP转乙酰酶在稳定期下调，酰基载体蛋白在中期和稳定期上调，长链脂肪酸-CoA连接酶在中期和晚对数期显著上调。此外，编码丙二酰-CoA ACP转酰酶、ACP、KASII和丙酰-CoA羧化酶β链的四个成簇基因在晚对数期被诱导。

*分支菌素系统转录变化*
部分mycofactocin合成相关基因在DBT培养中特定生长期上调，包括小蛋白、radical SAM成熟酶、血红素/黄素脱氢酶及转录调节子；前体基因则在晚对数期下调后又在稳定期回升。这与蛋白质组中mycofactocin相关蛋白丰度升高的现象一致。

*细胞被膜与细胞分裂改变*
超过50个细胞被膜合成/降解相关基因差异表达，如转糖基酶、转肽酶、肽聚糖循环和表面蛋白基因。岩藻糖（O抗原核苷酸糖）生物合成操纵子（IGTS8_peg5608-5610）在DBT培养中显著过表达。N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶及细胞分裂蛋白FtsI、FtsL、MraZ在稳定期显著上调，同时rRNA小亚基甲基转移酶RsmH基因也上调，可能缓解MraZ过量的毒害。多种外多糖/荚膜/O抗原/磷壁酸相关糖基转移酶基因在晚对数期和稳定期上调。染色体分配和隔膜形成基因则在早对数期下调。

*DBT脱硫过程中一般应激反应激活*
多种应激相关基因呈现差异表达，且随生长期变化。普遍应激蛋白基因、冷休克蛋白CspA在晚对数期和稳定期显著上调。毒素-抗毒素系统（如MazF毒素、Phd抗毒素）在中期和晚对数期上调。铁、钾、锌转运系统基因下调，而磷酸盐和锰转运基因在稳定期上调。tRNA修饰相关基因（TruA、TrmD）在晚对数期下调。多聚磷酸激酶基因在晚对数期和稳定期上调。编码转座酶的基因大多上调。WhiB家族转录调节因子中，IGTS8_peg3234上调，而IGTS8_peg902、IGTS8_peg3276下调。

*生长速率降低与形态变化*
生长实验显示，以DBT替代MgSO₄为硫源时，IGTS8的最大比生长速率降低约50%；DBT与MgSO₄混合培养则略有下降，表明生长减缓主要源于硫酸盐限制。扫描电镜显示DBT培养中细胞形状和大小异质（长杆、短杆、弯曲、不规则、棒状及多分裂细胞），而MgSO₄培养以均匀短杆为主；DBT培养的平均细胞尺寸（1.17×0.66 μm）大于MgSO₄培养（0.94×0.48 μm），提示细胞周期和分裂受到扰动。

**总结与讨论**
研究指出，IGTS8的转录组响应与蛋白质组谱大体一致，但部分基因在转录和翻译水平存在差异，推测生物脱硫条件下存在转录后调控以维持稳态。DBT培养中许多转录响应指向能量和资源节约、细胞被膜重塑、应激保护及生长减缓。下调肌醇分解代谢可能有利于代谢通量转向磷脂或抗氧化代谢物合成；氨基酸和脂肪酸降解有助于补充能量和前体；尿素循环和腈水合酶上调可能服务于解毒和氮/碳代谢平衡。磷酸盐、锰摄取上调而铁、钾、锌转运下调，反映了金属稳态的主动调整。冷休克蛋白和转座酶的诱导可能是应对营养应激和促进遗传适应的普遍机制。这些发现为代谢工程改造脱硫菌株提供了候选靶标，但大量假定蛋白的功能仍待鉴定。

**研究结论**
生物脱硫被视为一种应激信号，激发全局转录组响应，总体上与近期报道的蛋白质组重排一致。该应激反应既包含硫酸盐限制特异性适应，也包含一般性适应，远超常见的硫酸盐饥饿诱导反应。尽管转录组重排很大程度上依赖于生长期，但其主要目的是优化细胞保护、稳态和资源管理，同时减少生长和合成代谢活动。随着IGTS8基因组中检测到的假定蛋白的身份和功能在未来被揭示，生物脱硫条件下的进一步适应性反应将得以阐明。