基于hilA靶基因的沙门氏菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的开发与性能评价

《Microbiology Research》：Development and Analytical Evaluation of a hilA-Targeting TaqMan Real-Time PCR Assay for Salmonella enterica Detection

　　

快速可靠的沙门氏菌（Salmonella）分子检测对于实验室调查和传染病监测具有重要意义。本研究比较了六个候选分子靶标（hilA、invA、phoP、fimA、rpoS和spvA），并开发了一种针对hilA基因的TaqMan实时荧光定量PCR（TaqMan real-time PCR）检测方法用于肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）的检测。在常规PCR筛选中，研究人员发现hilA-M1-F/R引物对在所测试的分离株面板中展现出最一致且可重复的扩增效果，因此被选用于后续的检测方法开发。所开发的检测方法在1 ng/μL至10 fg/μL的线性基因组DNA范围内显示出93.4%的扩增效率（amplification efficiency）和0.9988的决定系数（R2）。在实验条件下确定的检测限（detection limits）为细菌悬液102 CFU/mL和基因组DNA 10 fg/μL。所有24株经全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）确认的、代表多种血清型和序列型（sequence types）的肠道沙门氏菌分离株均能被稳定检出，而在包含15株非目标细菌菌株或分离株的扩展面板中未观察到特异性扩增。在初步的概念验证实验中，该检测方法还能在人工污染牛奶和胡萝卜基质中检出肠道沙门氏菌DNA。这些结果表明，所开发的hilA靶向TaqMan检测方法在所评估的实验框架内具有良好的分析性能。然而，在将其应用于常规诊断、食品检测或流行病学监测之前，还需要利用地理分布多样的肠道沙门氏菌分离株库、更多的非目标生物、内部扩增对照（internal amplification control）、天然污染的食品、原始临床、兽医和环境标本以及独立实验室进行更广泛的验证。

研究背景与研究目的

沙门氏菌病（salmonellosis）是全球重要的公共卫生问题，也是主要的食源性细菌感染之一。传统的细菌培养法是沙门氏菌检测的金标准，但其耗时长、需获得纯培养并进行生化及血清学鉴定，存在局限性。分子诊断方法，特别是实时荧光定量PCR（real-time PCR），能够提供快速、灵敏且特异的检测。已有多个基因如invA、hilA、phoP、fimA、rpoS和spvA被提议作为沙门氏菌分子检测的靶标。其中，hilA基因位于沙门氏菌毒力岛1（Salmonella pathogenicity island 1, SPI-1），编码调控上皮细胞入侵基因表达的转录调节因子，其染色体定位、功能重要性以及在多种沙门氏菌血清型中的存在使其成为理想的PCR检测靶点。尽管hilA此前已被用作检测靶标，但在哈萨克斯坦，尚未有研究对多个分子靶标进行比较评估并据此开发hilA靶向的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。因此，本研究旨在比较六个候选分子靶标，筛选出在测试分离株面板中扩增最一致的引物-靶标组合，并在此基础上开发和评估一种用于检测肠道沙门氏菌（S. enterica）的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。

研究内容与结论

研究人员通过对六个候选靶标（hilA、invA、phoP、fimA、rpoS和spvA）的比较筛选，确定了hilA基因作为最优靶标，并成功开发了一种针对hilA基因的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该方法的分析灵敏度达到细菌悬液10² CFU/mL和基因组DNA 10 fg/μL，扩增效率为93.4%，线性范围良好。在包含24株经全基因组测序（WGS）确认的、来自哈萨克斯坦国家微生物保藏中心（National Collection of Microorganisms, NCM）的多血清型和多序列型肠道沙门氏菌分离株的测试中，该方法实现了100%的特异性检出，并对15株非目标细菌无交叉反应。此外，在人工污染牛奶和胡萝卜基质的初步概念验证实验中，该方法也能成功检出沙门氏菌DNA。这项研究的重大意义在于，这是哈萨克斯坦首次通过比较多个靶标的方法开发出基于hilA的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测体系，为该国沙门氏菌病的实验室诊断和监测提供了新的有力工具，但其在实际应用前仍需更广泛的验证。

主要关键技术方法

研究人员首先从GenBank数据库检索六个候选靶标基因的核苷酸序列，并使用MPrimer软件设计引物，通过BLASTn进行计算机模拟特异性评估。随后，采用常规多重PCR对这些候选靶标进行初步筛选，评估引物对的扩增一致性。基于筛选结果，选择hilA基因，并设计了一对更短的内引物（B-hilA-F/R）和一个TaqMan水解探针，开发了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。研究使用的细菌分离株均来源于哈萨克斯坦阿拉木图的M. Aikimbayev国家特别危险感染科学中心（NSCEDI）的国家微生物保藏中心（NCM），包括人类和动物源分离株。分析灵敏度通过十倍的连续梯度稀释基因组DNA和细菌悬液进行评估。分析特异性则通过一个包含15株非目标细菌的扩展面板进行评估。最后，在人工污染的牛奶和胡萝卜基质中进行了初步的概念验证实验。

研究结果

3.1 靶标基因筛选与最佳引物组的选择

通过比较六个候选靶标，研究人员发现hilA-M1-F/R和invA-M1-F/R引物对扩增最稳定，分别产生151 bp和234 bp的特异性扩增子。而靶向phoP、fimA、rpoS和spvA的引物对在某些分离株中无扩增或扩增不一致。更重要的是，hilA引物对在所有测试的沙门氏菌分离株中均能稳定扩增出预期产物，而invA引物对则在部分不常见血清型的分离株中未能检测到预期的234 bp产物。因此，基于hilA引物对的稳定性和可重复性，它被选作后续TaqMan检测方法开发的靶标。

3.2 筛选引物组的分析特异性

通过常规PCR和琼脂糖凝胶电泳评估，hilA-M1和invA-M1引物组仅在含有沙门氏菌DNA的反应中产生特异性扩增产物，而对志贺氏菌属（Shigella）、耶尔森氏菌属（Yersinia）和弧菌属（Vibrio）等非沙门氏菌物种的DNA无交叉反应，证实了这两个引物组在所评估细菌面板中的分析特异性。

3.3 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的开发与分析灵敏度

基于靶标筛选结果，研究人员开发了hilA靶向的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，设计了扩增85 bp片段的B-hilA-F/R引物和FAM/BHQ1标记的TaqMan探针，并使用重组质粒pTG19-T-hilA作为阳性对照。分析灵敏度测试显示，Ct值与基因组DNA浓度呈良好的线性关系，在1 ng/μL至10 fg/μL范围内，斜率为-3.491，R²为0.9988，扩增效率为93.4%。在所有三次独立运行中均能稳定检出的最低基因组DNA浓度为10 fg/μL，而1 fg/μL则无法检出。对于细菌悬液，最低检出浓度为10² CFU/mL。

3.4 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的分析特异性

使用包含15株非目标细菌的扩展面板评估分析特异性，结果显示，在所有测试的非沙门氏菌生物中均未检测到hilA靶标的特异性扩增，而阳性对照则产生预期的扩增信号，表明在所测试的微生物范围内无交叉反应。

3.5 人工污染食品样本中的检测性能

在初步概念验证实验中，研究人员将沙门氏菌肠炎血清型6S菌株以约2×10² CFU/mL的初始浓度人工污染牛奶和胡萝卜基质，并在37°C下孵育18±2小时后提取DNA。结果显示，所有人工污染样品均检测到hilA靶标的特异性扩增，胡萝卜基质的Ct值范围为32.59至35.10，牛奶基质为24.45至29.28，而未接种的基质对照无扩增。由于未测定提取DNA时的实际细菌浓度，这些Ct值不能直接用于定量分析，仅作为定性概念验证。

3.6 使用细菌分离株评估检测性能

使用24株经WGS确认的沙门氏菌分离株和1株奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）分离株（18S）评估检测性能。结果显示，所有24株沙门氏菌分离株均产生了hilA靶标特异性扩增，且Ct值均在预设阈值（≤37）内。大多数菌株的平均Ct值低于24，而鼠伤寒沙门氏菌29S菌株（平均Ct=31.47）和都柏林沙门氏菌25S菌株（平均Ct=36.66）表现出较高的Ct值。奇异变形杆菌18S分离株和阴性对照无扩增。三次独立运行间的变异系数（CV）介于0.38%至2.12%之间，均低于5%的预设阈值，表明检测方法具有可接受的批间重现性。

3.7 整体检测方法开发与分析评估流程

研究总结了从六个候选靶标的比较筛选，到选择hilA靶标，再到开发TaqMan检测方法，并最终进行评估的完整工作流程，涵盖了分析灵敏度、特异性、批间重现性、对WGS确认菌株的性能以及在人工污染食品中的检测能力。

讨论与结论

研究人员指出，本研究的主要贡献在于对六个候选分子靶标进行了比较实验评估，并基于此开发了哈萨克斯坦首个hilA靶向的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。hilA基因位于染色体上的SPI-1毒力岛，其功能重要性和在本次测试菌株中的稳定扩增为其作为检测靶标提供了生物学依据。该检测方法在遗传和血清学多样性的沙门氏菌分离株中均表现良好，覆盖了包括肠炎、鼠伤寒、猪霍乱、都柏林、副伤寒B、婴儿、科特布斯、伤寒、阿纳图姆、利奇菲尔德和慕尼黑在内的多种血清型，这对于应对沙门氏菌病复杂的流行病学具有重要意义。在分析性能方面，该方法展示了良好的灵敏度、特异性和批间重现性。然而，研究人员也坦诚地指出了研究的局限性：菌株数量有限且主要来自哈萨克斯坦，未能涵盖沙门氏菌的全部多样性；分析灵敏度是通过有限次数的重复实验确定的，并非统计学意义上的LOD₉₅；Ct≤37的阈值是经验性的，未经ROC曲线验证；非目标菌株面板虽已扩展但仍有限；食品基质实验仅为初步概念验证，缺乏内部扩增控制（IAC）以评估潜在的PCR抑制；且该方法是单靶标定性方法，不能确定菌株身份、血清型、毒力潜力或细菌活性，也未进行多中心评估。

结论翻译：

在本研究中，开发并分析评估了一种靶向hilA基因的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，用于检测肠道沙门氏菌。对六个候选分子靶标（hilA、invA、phoP、fimA、rpoS和spvA）的比较筛选表明，hilA-M1-F/R引物对在所使用的实验条件下，于测试分离株面板中提供了最稳定和可重复的扩增，因此被选用于后续的TaqMan检测方法开发。所开发的检测方法在测试条件下，对细菌悬液的实验检测限为10² CFU/mL，对基因组DNA为10 fg/μL，在1 ng/μL至10 fg/μL的线性范围内扩增效率为93.4%，R²为0.9988。在测试的非目标细菌面板中未观察到交叉反应。所有24株经WGS确认的沙门氏菌分离株均在预设的Ct阈值（≤37）内产生阳性扩增，包括Ct平均值最高的都柏林沙门氏菌25S菌株（36.66 ± 0.14）。奇异变形杆菌比较株和阴性对照无特异性扩增。该检测方法还能在人工污染的牛奶和胡萝卜样品中检出沙门氏菌DNA。这些发现表明，所开发的hilA靶向TaqMan实时荧光定量PCR检测方法在所评估的实验条件下具有令人鼓舞的分析性能。然而，本研究并未确立其在常规诊断、食品检测、流行病学监测或One Health应用中的就绪状态。在考虑此类应用之前，需要使用更大规模和地理分布多样的菌株库、天然污染的食品、原始临床、兽医和环境标本以及独立实验室进行进一步的验证。