《Microbiology Spectrum》：Development and validation of a higher-throughput, automated FAMA assay for varicella-zoster virus antibody detection, offering a scalable alternative to the classic 12-well slide method
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经典的荧光抗体膜抗原（FAMA）载玻片法是水痘-带状疱疹病毒（VZV）抗体检测的金标准，但该方法存在通量低、判读主观、操作劳动强度大及数据可追溯性差等局限性。为克服上述不足，研究人员基于经典FAMA原理开发并初步验证了一种96孔板FAMA检测方法，用于VZV抗
经典的荧光抗体膜抗原（FAMA）载玻片法是水痘-带状疱疹病毒（VZV）抗体检测的金标准，但该方法存在通量低、判读主观、操作劳动强度大及数据可追溯性差等局限性。为克服上述不足，研究人员基于经典FAMA原理开发并初步验证了一种96孔板FAMA检测方法，用于VZV抗体的定量检测。以VZV感染的MRC-5细胞为底物制备高通量FAMA板，并采用自动化系统检测临床样本。研究进行了临界值确定、全面方法学验证以及与经典FAMA载玻片法的一致性比较。在所测试条件下，所建立的高通量FAMA检测方法在信号特异性和灵敏度方面表现出与经典方法相当的性能，同时提高了通量并缩短了周转时间。自动化判读与数据存储确保了结果的客观性与可追溯性，与经典FAMA载玻片法的总体符合率为88%（r = 0.886）。本初步研究表明，高通量FAMA检测方法有潜力作为经典FAMA载玻片法的替代方案，用于大规模VZV血清学调查及水痘/带状疱疹疫苗免疫原性评价，为疫苗和药物开发提供更高效、客观的工具。
重要性：水痘-带状疱疹病毒（VZV）抗体检测的金标准——膜抗原荧光抗体（FAMA）法劳动强度大、主观性强，且不适合大规模使用。为克服这些局限，研究人员开发并初步验证了一种高通量、自动化的96孔FAMA方法。该新方法在保持良好灵敏度和特异性的同时，能够实现快速、客观且可追溯的结果。初步验证显示与经典方法的符合率为88%（r = 0.886），在特异性、选择性、精密度、线性、稳定性和耐用性方面均表现可接受。这种可扩展的方法显示出满足临床需求的潜力，可作为大规模抗体检测中人工操作的替代方案，支持更高效的VZV疫苗开发和免疫监测。
论文解读：高通量自动化FAMA检测方法的建立与初步验证
**研究背景与现存问题**
水痘是由水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus, VZV）引起的急性呼吸道传染病，主要流行于儿童群体，超过90%的个体在青春期前经历自然感染。2019年全球疾病负担研究估计，全球每年约发生8400万例水痘，相关死亡约1.5万例。在中国法定传染病监测系统中，水痘是继结核病和流感之后第三常见的疫苗可预防疾病。原发感染后，VZV在神经节建立终身潜伏，数十年后病毒再激活可导致带状疱疹，严重影响老年人生活质量。疫苗接种是预防VZV感染最有效的干预手段。截至2024年，全球已有56个国家将水痘疫苗纳入常规儿童免疫规划，其中4种单价水痘疫苗获得世界卫生组织（WHO）资格预认证。在疫苗研发和头对头比较研究中，免疫原性评价不可或缺，然而方法学异质性和固有技术瓶颈严重制约了相关研究的推进。
目前VZV抗体检测方法包括荧光抗体膜抗原（fluorescent antibody to membrane antigen, FAMA）试验、免疫粘附血凝试验、中和试验和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）。其中仅FAMA和ELISA在临床得到广泛应用。作为金标准，经典FAMA载玻片法与临床保护相关性良好，广泛用于水痘和带状疱疹疫苗免疫原性评价。美国CDC免疫实践咨询委员会（ACIP）已认可FAMA滴度≥1:4作为接种后16周血清学保护相关性指标。然而，经典FAMA载玻片法完全手工操作，劳动强度大、检测通量低、终点判读主观、批间重复性不理想、数据可追溯性差，严重限制了其在大规模临床样本筛查和多疫苗比较评估中的应用。
**研究目的与意义**
为解决上述未满足的需求，并为水痘疫苗（一级预防）和带状疱疹疫苗（包括减毒活疫苗和重组亚单位疫苗）临床试验提供通用免疫原性评价工具，研究人员基于经典FAMA原理建立了高通量、自动化、标准化、数据集成化的VZV抗体检测平台。初步验证结果表明，该新方法与经典FAMA相比具有相当的灵敏度和特异性，同时显著提高通量、缩短检测周转时间，并实现客观、可追溯的数据归档，有潜力满足临床诊断和监管要求。该优化方法与传统载玻片法的总体符合率达88%，相关系数为0.886。
**主要技术方法**
研究人员以北京万泰生物药业股份有限公司保存的VZV V-Oka株感染美国典型培养物保藏中心（ATCC）来源的MRC-5细胞，MOI为0.01，待细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）达60%以上后消化收获，以每孔10,000-20,000个细胞的密度铺入96孔细胞培养板，经甲醛固定制备高通量FAMA板。临床样本检测采用自动化系统，以高内涵显微镜（Molecular Devices）采集图像，MetaXpress Powercore软件完成自动分析。临界值确定采用106份FAMA载玻片法阴性的血清样本（来自湖北省疾病预防控制中心III期临床试验，批件号2023-002-02），以单侧95百分位数法按稀释度分层确定。方法学验证参考ICH M10及《疫苗临床试验抗体分析方法研究技术指导原则》，涵盖特异性、选择性、相对准确度与精密度、线性、稳定性和耐用性。方法一致性研究采用III期临床试验（ChiCTR20252239）中380份接种前血清和610份接种后42天血清样本，与FAMA载玻片法平行检测，进行Spearman相关分析和符合率评估。
**研究结果**
*建立与优化高通量FAMA检测方法。* 研究人员将传统12孔玻璃载玻片格式改造为与自动化仪器兼容的96孔微孔板平台，使检测效率和通量提高70%以上。对100份样本的操作时间从约170分钟缩短至50分钟，其中图像采集/分析步骤因采用机械臂和高内涵显微镜全自动完成而无需人工操作。该流程包括高通量FAMA板制备、临床样本检测和自动化仪器判读三个关键步骤。
*优化高通量FAMA板的制备条件。* 系统性考察了VZV细胞病变程度、细胞铺板密度和固定条件三个关键参数。CPE低于60%时病毒膜糖蛋白表达不足、荧光信号弱，而CPE高于60%可显著增强信号强度和检测灵敏度，故选用60-100% CPE的细胞制备FAMA板。每孔10,000-20,000个细胞的铺板密度可形成均匀单层且无细胞堆叠，便于仪器自动聚焦和图像分析。交联型固定剂（戊二醛和甲醛）通过醛基-氨基交联形成分子间亚甲基桥，维持细胞完整性和膜抗原的自然分布，优于丙酮固定。经Hoechst 33342核染色评估，三批独立制备的板间细胞计数未见统计学显著差异（P > 0.05），批内变异系数均低于20%，证实优化条件具有良好的批间一致性和均匀性。
*优化临床样本检测条件。* 针对临床血清样本中的非特异性荧光干扰自动化斑点计数的问题，研究人员对样本稀释液配方、孵育时间和检测平台进行了优化。结果显示，氯化钠通过屏蔽静电吸附减少非特异性结合，甘露醇通过稳定蛋白质构象抑制疏水相互作用以降低背景噪音，尿素通过破坏氢键打断弱非特异性蛋白相互作用；三者联合应用在降低血清基质干扰方面具有协同效应。样本孵育30-70分钟及二抗孵育30-60分钟内，阳性信号强度和背景信号均保持稳定。在荧光显微镜、斑点分析仪、Celigo成像系统和高内涵显微镜四种平台中，高内涵显微镜综合性能最优并被选定为标准检测平台。
*临界值的建立。* 共纳入106份阴性血清的324个有效数据点。各稀释度下背景信号计数呈典型右偏分布，Anderson-Darling正态性检验确认数据不服从正态分布。若采用基于正态分布的常规置信区间法，会因离群值高估临界值而增加假阴性。因此采用与分布无关的单侧95百分位数法，针对4倍、8倍、16倍和≥32倍稀释度分别定义分层临界值，以避免低稀释度下假阳性及近阈值区间的假阴性错误。
*方法学验证。* 在特异性评价中，阳性参考血清与VZV病毒液（1 × 10
6 TCID
50/mL）按1:1预孵育后，因抗体被病毒颗粒中和，滴度由32降至<4，证实检测信号特异性来源于抗VZV抗体，而非与MRC-5细胞成分或其他基质物质的非特异性结合。选择性评价中，添加5%溶血或2 mM高脂乳剂的阴性和阳性血清样本均获得与理论值一致的滴度，表明常见内源性血清物质不干扰检测性能。相对准确度和精密度评价中，不同试剂批次、操作者、检测时间和重复次数下，相对偏倚和几何变异系数（GCV）均低于15%。线性分析显示在16至8,192倍稀释范围内R2 = 0.996，未见明显钩状效应。稳定性评价显示检测试剂和临床样本在2-8℃可稳定保存至少5天，室温可耐受8小时，并可耐受多达5次冻融循环而无性能下降。耐用性评价中，环境放置时间、样本和二抗孵育时间及图像采集时间的微小变动均未显著影响检测性能。
*方法一致性评价。* 高通量FAMA法与经典FAMA载玻片法检测990份临床样本（380份接种前和610份接种后42天血清），总体符合率为88%（阴性符合率89%，阳性符合率87%）。按接种状态分层，接种前总体符合率91%（阴性85%，阳性92%），接种后总体符合率86%（阴性94%，阳性85%）。Spearman相关分析显示两方法间呈强正相关（r = 0.886，95% CI: 0.868-0.902，n = 990，P < 0.0001）。Passing-Bablok回归分析（log?转换后）方程为log?y = 1.003 × log?x + 0.976，斜率1.003表明无比例偏倚，截距0.976提示存在恒定偏倚，估计偏倚为0.853（95% CI: 0.720-0.986），相对偏倚为13%，提示载玻片法灵敏度较低，存在恒定系统性差异。
**讨论总结与结论**
本研究将传统12孔玻璃载玻片格式重新设计为与自动化实验仪器兼容的96孔微孔板平台，检测效率提高70%以上。针对阳性信号重现性和非特异性背景荧光干扰两大关键技术瓶颈，系统优化了细胞病变程度、细胞铺板密度、固定液配方、样本稀释液组成和孵育时间等关键实验条件。通过整合高内涵成像系统实现自动化信号识别，完全替代人工判读，将传统半定量FAMA转化为输出连续、精确斑点计数的自动化半定量检测平台。从方法学标准化角度，通过关键试剂质控和参考标准品建立保证检测结果的批间可比性和可转移性。所有分析性能指标初步符合疫苗临床试验血清学检测技术要求，与经典载玻片法的一致性分析显示强相关性和良好总体符合率。
研究人员指出，仍需开展大规模、多中心的相关性研究，本研究的初步评估还需针对其他疱疹病毒、类风湿因子、自身抗体及抗试剂抗体等进行进一步检测，方可应用于监管临床试验。更大地理区域和更多疫苗产品的临床样本将有助于进一步验证该平台的稳健性。
综上所述，本研究建立了标准化高通量FAMA检测方法，用于水痘和带状疱疹疫苗临床试验中VZV抗体滴度的定量检测。该方法与金标准载玻片FAMA法具有高度一致性，并整合了多项优越技术特征，包括初步可接受的性能证据、更高的检测通量、客观信号判读、完整数据可追溯性和全自动化操作。经系统化标准化优化和严格的全参数方法学验证，该新方法有望作为VZV血清学检测的试点替代标准化方法，为临床试验实施、监管评价、常规标本检测和长期免疫原性监测提供可靠的技术基础。
