《Microbiology Spectrum》：An institutional investigation of false-positive signals in an automated blood culture system: evaluating clinical predictors and molecular etiologies
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在血流感染中，及时启动适当的抗菌治疗对于降低发病率和死亡率至关重要。自动化血培养监测系统能够有效筛除阴性标本，使临床实验室能够优先处理真阳性培养物。然而，未确认的阳性信号（即假阳性）带来了诊断上的挑战。本研究旨在对BD BACTEC FX系统内的假阳性率进行一
在血流感染中，及时启动适当的抗菌治疗对于降低发病率和死亡率至关重要。自动化血培养监测系统能够有效筛除阴性标本，使临床实验室能够优先处理真阳性培养物。然而，未确认的阳性信号（即假阳性）带来了诊断上的挑战。本研究旨在对BD BACTEC FX系统内的假阳性率进行一项机构性评估，评估分析前及临床变量，并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、聚合酶链式反应（PCR）和下一代测序（NGS）技术，探究细菌和真菌核酸的潜在存在情况。在为期15个月的时间内，研究人员评估了80个假阳性自动化血培养瓶（ABC）（显示阳性生长信号但常规传代培养无生长）和30个阴性信号对照瓶。尝试使用MALDI-TOF MS（BD MALDI Biotyper Sirius, Bruker Daltonics）进行直接鉴定。通过扩增细菌16S rRNA、真菌28S rRNA及ITS基因区域，随后对扩增子进行NGS靶向测序，来探究细菌和真菌DNA的存在情况。同时记录了临床参数、阳性报警时间（TTP）和血气参数。该机构的假阳性率为0.2%（80/41,073瓶），完全符合制造商规格和已发表的基准数据。在所有假阳性瓶或阴性对照瓶中均未检测到细菌DNA（16S rRNA）。在80个假阳性样本中的9个（11.25%）中扩增出了真菌DNA（28S rRNA D1/D2区域）；然而，所有样本的ITS区域扩增均为阴性。序列分析鉴定了低相对丰度的多种环境霉菌类群（Aspergillus melleus、Alternaria infectoria、Amorphotheca resinae、Alternaria conjuncta、Eremomyces bilateralis、Pseudomicrostroma glucosiphilum和Aspergillus steynii）。在年龄、白细胞计数（WBC）或C反应蛋白（CRP）水平方面，真菌DNA阳性组与阴性组之间未观察到统计学显著差异（P > 0.05）。所有直接MALDI-TOF MS评分均低于1.70，这与缺乏完整微生物蛋白质生物量的情况一致。真菌DNA阳性的假阳性瓶的中位TTP为68.0小时，其中数个瓶子耗时长达109小时才发出信号。BD BACTEC FX系统表现出高度的操作特异性，机构假阳性率为0.2%。全面的分子分析证实，假阳性信号并未掩盖被遗漏的真阳性临床病原体。在少数瓶子中零星鉴定出的不同真菌DNA代表的是临床上无意义的环境本底污染。不建议延长常规血培养瓶的培养周期，因为标准配方并非用于霉菌回收。在临床怀疑霉菌感染的情况下，建议直接接种到专用真菌培养基上进行传代培养，或订购专用的真菌诊断检测。
研究背景与目的
脓毒症（sepsis）是由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的临床状况，每年在全球导致约1100万人死亡。血培养（blood culture）仍是诊断脓毒症的“金标准”，但传统方法需24-72小时才能获得阳性结果并鉴定病原体，这一延迟常迫使临床医生采用广谱经验性治疗，进而导致住院时间延长、费用增加和抗菌药物耐药性的发展。自动化血培养监测系统（如BD BACTEC FX）虽能高效筛除阴性标本，但会产生一种称为“假阳性”（false positivity）的信号——即系统报阳但培养物中不含活的微生物。此现象会引发不必要的抗生素治疗、延长住院并增加成本。现有研究对假阳性信号的分子病因学了解有限，尤其是关于是否存在隐藏的病原体核酸或非活性的本底污染尚存争议。因此，本研究旨在对该三级学术医院内BD BACTEC FX平台的假阳性血培养信号进行全面机构分析，评估分析前及临床预测因素（包括白细胞计数、C反应蛋白（CRP）、血气及阳性报警时间（TTP）），并运用多靶点分子检测面板（细菌16S rRNA、真菌28S rRNA及ITS区域）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS），确定这些未确认信号究竟代表了被遗漏的真阳性感染还是非活性的本底核酸痕迹。
关键技术方法概述
研究人员从Erciyes大学医学院中心实验室的41,073份血培养样本中筛选出80个假阳性瓶（BD BACTEC FX系统报阳但常规微生物培养及革兰染色阴性）和30个阴性信号对照瓶。主要技术方法包括：（1）使用MALDI Biotyper Sirius系统（Bruker Daltonics）对血培养样本进行直接微生物鉴定；（2）采用SuPure血液DNA分离试剂盒提取总基因组DNA，并分别针对细菌16S rRNA V3-V4区域、真菌28S rRNA D1/D2区域及真菌ITS区域进行聚合酶链式反应（PCR）扩增；（3）对PCR阳性产物使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒建库，并在Illumina iSeq100平台上进行双端150 bp测序（NGS），随后通过Kraken2宏基因组系统（RefSeq 2022.02数据库）进行分类学分析；（4）设计受控DNA加标实验，将纯化的曲霉属（Aspergillus）基因组DNA按梯度浓度（0、10、100、1,000、10,000基因组拷贝/瓶）加入标准血培养瓶，监测其在BD BACTEC FX系统中120小时的信号变化。
研究结果
一般研究统计：在研究期间，共有41,073个血培养瓶送检。其中8,312瓶（20.2%）在自动化系统中报阳，32,761瓶（79.8%）保持阴性。在报阳的8,312瓶中，经常规微生物培养检出生长者共8,232瓶（99%），剩余80瓶（1%）被评估为假阳性。所有瓶子的假阳性率为0.2%。
MALDI-TOF MS结果：对所有110个血培养样本（80个假阳性、30个阴性）的直接鉴定尝试中，没有一个样本的鉴定得分超过1.70。因此，本研究未能通过MALDI-TOF MS直接从血培养中成功鉴定微生物。阳性对照瓶的得分均高于1.70并被正确识别。
分子分析发现：在所有110个样本（包括假阳性和阴性样本）中，均未检测到细菌16S rRNA或真菌ITS区域的PCR阳性。然而，在80个假阳性瓶中的9个（11.25%）中获得了真菌28S rRNA D1/D2区域的阳性PCR产物。在30个阴性信号瓶中，分子方法未检测到微生物DNA。在受控加标实验中，注入10-100基因组拷贝/瓶纯化曲霉DNA的血培养瓶在120小时孵育期内未报阳。而注入极高非生理浓度（≥1,000拷贝）的瓶子显示出晚期代谢背景波动。这证实裸真菌核酸在正常生理条件下不会直接调节或触发比色CO2传感器。对9个样本进行的NGS分析揭示了各样本中相对丰度最高的真菌物种，包括Aspergillus melleus、Alternaria infectoria、Amorphotheca resinae、Alternaria conjuncta、Eremomyces bilateralis、Pseudomicrostroma glucosiphilum和Aspergillus steynii等环境霉菌。
患者与临床数据：80名假阳性患者的平均年龄为34.4岁（男50例，女30例），平均白细胞计数为8,585/μL，平均CRP值为60.68 mg/L。检测到真菌DNA的9名患者平均年龄24.3岁（男5例，女4例），平均白细胞计数10,256/μL，平均CRP值61.19 mg/L。根据患者出院小结，无一例考虑真菌感染，也未启用抗真菌治疗。在申请了血气分析的14例患者中，3例检测到酸中毒（其中1例合并高碳酸血症）。但在9例NGS法证实存在微生物的患者中，仅有2例申请了血气分析，其结果未见高碳酸血症或酸中毒。真菌DNA阳性瓶的中位TTP为68.0小时（范围：21-109小时）。比较真菌DNA阳性组（n=9）与阴性组（n=71），在年龄、白细胞计数和CRP方面均未发现统计学显著差异（Mann-Whitney U检验；年龄P=0.164；WBC P=0.183；CRP P=0.518）。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究中BD BACTEC FX系统的假阳性率为0.2%，与文献报道一致，证实了该系统的高特异性和可靠性。尽管部分假阳性患者存在白细胞升高、酸中毒或高碳酸血症，但真菌DNA阳性亚组中并无此类代谢紊乱，表明宿主代谢异常不太可能是该亚组假阳性的主要原因。真菌DNA阳性瓶的中位TTP长达68小时（最长达109小时），强烈支持阳性信号并非由活跃复制的临床真菌病原体引起，而是源于非活性、高度片段化的真菌DNA成分及潜在的制造源性化学残留物所触发的缓慢背景物理化学反应或荧光传感器改变。分子研究的关键发现是，假阳性瓶并未掩盖被遗漏的真阳性临床病原体：所有假阳性标本的细菌16S rRNA PCR均为阴性，直接MALDI-TOF MS评分均低于1.70。NGS鉴定出的真菌种类多为广泛存在的环境污染物，文献中未见其引起人类真菌血症的报道。受控加标实验进一步证实，游离真菌DNA不能直接触发血培养瓶的比色CO2传感器。因此，在少数假阳性瓶中检测到的低水平真菌DNA代表的是偶然的环境核酸片段或在生产/采样过程中引入的微量孢子，而非触发设备报阳的主要机制。分析前因素（如升高的宿主细胞代谢活性、采血量过多或短暂高碳酸血症）仍是未确认生长信号的主要生理驱动因素。
研究结论为：BD BACTEC FX自动化血培养系统性能高度可靠，维持着0.2%的低假阳性率。全面的分子分析证实，假阳性信号并未掩盖被遗漏的真阳性临床病原体。在少数瓶子（11.25%）中零星鉴定出的不同真菌DNA代表的是临床上无意义的环境本底污染。不建议延长常规血培养瓶的培养周期，因为标准配方并非用于霉菌回收。在临床怀疑霉菌感染的情况下，建议直接接种到专用真菌培养基上进行传代培养，或订购专用的真菌诊断检测。对假阳性信号的临床管理应依赖于对患者的全面评估，并与商业分子检测面板相结合，以支持抗菌药物管理。
