新生儿肠道感染通过肠上皮细胞NOD1模式识别受体与神经免疫信号改变介导微生物群-肠-脑轴破坏

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Neonatal enteric infection disrupts the microbiota–gut–brain axis through pattern recognition receptors and altered neuroimmune signaling

　　

生命早期肠道感染会破坏正在发育的微生物群-肠-脑（microbiota–gut–brain, MGB）轴。研究人员利用新生儿肠道致病性大肠杆菌（enteropathogenic Escherichia coli, EPEC）模型，发现肠上皮细胞（intestinal epithelial cell, IEC）核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding oligomerization domain, NOD）1信号在整个早期发育及成年期协调神经免疫结局。在出生后第7天（postnatal day, P7）感染的新生小鼠出现回肠炎症，促炎细胞因子和单核细胞/巨噬细胞浸润增加，以及肌间神经丛神经元丢失，这些现象见于野生型小鼠但在NOD1条件性敲除（Nod1^ΔIEC）小鼠中未出现。这些缺陷持续至成年期（P56），表现为肠道通透性增加、持续的炎症/修复特征、神经炎症、神经发生改变和识别记忆受损，而这些改变在Nod1^ΔIEC小鼠中均不存在，从而确立了IEC NOD1在长期MGB重塑中的关键作用。最后，研究人员从益生菌乳杆菌菌株中分离出具有生物活性的肽聚糖片段（胞壁肽，muropeptide）并作为潜在治疗药物进行测试。令人振奋的是，补充胞壁肽可减轻新生儿EPEC诱导的黏膜炎症和肠神经元丢失，且不改变细菌载量，其机制可能通过IEC NOD2实现。综上，这些发现确定了IEC NOD依赖性信号将早期肠道感染与持续性肠脑功能障碍联系起来，并揭示益生菌来源的胞壁肽是候选治疗药物。

研究背景：生命早期肠道感染是全球重大健康挑战，是儿童发病和死亡的重要影响因素，其发育后果远超急性腹泻本身。肠道致病性大肠杆菌（enteropathogenic Escherichia coli, EPEC）是5岁以下儿童腹泻的主要原因，可引起炎症和黏膜屏障功能破坏。生命早期是肠道微生物群、免疫系统和神经系统快速成熟的关键窗口期，肠道感染可能干扰微生物群-肠-脑（microbiota–gut–brain, MGB）轴这一连接胃肠道与中枢神经系统的双向通讯网络。先天免疫信号尤其是肠上皮细胞（intestinal epithelial cell, IEC）高表达的核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding oligomerization domain, NOD）1受体在宿主-微生物互作中发挥关键作用，但新生儿肠道感染导致持续性肠脑功能障碍的机制仍不明确。研究人员前期发现NOD1/NOD2双敲除小鼠在成年期急性心理应激后表现出行为异常，且该效应定位于IEC NOD1。本研究旨在探讨IEC NOD1是否调控新生儿EPEC感染后的长期MGB轴紊乱。

研究人员利用IEC条件性NOD1敲除（Nod1^ΔIEC）小鼠及野生型（wild-type, WT）同窝对照（C57BL/6背景），在出生后第7天（postnatal day, P7）经口灌胃EPEC（O127:H6株E2348/69）或LB对照，通过实时定量PCR、流式细胞术、免疫荧光、Ussing chamber、行为学测试、液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC/MS）及回肠类器官培养等技术，系统研究了新生儿EPEC感染对肠道、免疫和神经系统的影响。主要结论为：IEC NOD1信号是介导新生儿EPEC感染引起急性肠道炎症、肌间神经丛神经元丢失及成年期持续性肠屏障功能障碍、海马神经炎症、神经发生改变和认知缺陷的关键上游调控因子；益生菌来源的胞壁肽（muropeptide）可通过IEC NOD2信号减轻EPEC诱导的黏膜炎症并恢复肠道神经元数量，是潜在的治疗候选药物。

主要关键技术方法包括：Nod1^ΔIEC（Vil.Cre⁺Nod1^f/f）小鼠及WT同窝对照（C57BL/6背景）；EPEC（E2348/69）于P7经口灌胃感染（10⁵ CFU）；Ussing chamber检测回肠离子分泌和通透性；qPCR检测基因表达；流式细胞术分析免疫细胞组成；免疫荧光和全组织铺片染色计数肌间神经元；LC/MS分析胞壁肽组成；回肠类器官感染模型结合NOD2抑制剂验证机制；行为学测试（新物体识别NOR、明暗箱L/D、旷场OFT）。

研究结果：新生儿EPEC感染在P14破坏肠屏障结构和功能。WT感染小鼠绒毛-隐窝轴长度缩短，Ki67⁺增殖细胞减少，Muc2和Slc26a3表达升高，PAS⁺杯状细胞增多，而Nod1^ΔIEC小鼠无这些变化，说明NOD1信号降低感染期间IEC增殖并促进杯状细胞分化。新生儿肠道细菌感染损伤肠神经系统。WT感染小鼠回肠Bdnf和S100b表达升高，ANNA-1⁺肌间神经元数量显著减少，Nod1^ΔIEC小鼠无此损伤，表明肠神经系统（enteric nervous system, ENS）是新生儿肠道感染的易感靶点。EPEC诱导的肠道炎症依赖IEC NOD1。WT感染小鼠促炎和调节性细胞因子（Il1β、Il6、Il12、Il10、Il22）、模式识别受体（Tlr4、Nod2）及趋化因子（Ccr2、Ccl2、Cxcr1、Cxcl1）表达升高，单核细胞和巨噬细胞浸润增加，这些效应在Nod1^ΔIEC小鼠中均缺失。IEC NOD1介导成年期持续性肠屏障功能障碍和肠道炎症。成年（P56）WT感染小鼠回肠通透性（电导和FITC flux）增加，Il6、Il12、Ifnγ、Il22、Nod2、Ccl2、Cxcr1表达升高，黏膜Iba1⁺巨噬细胞增多，Nod1^ΔIEC小鼠无此改变；肌间神经元总数恢复，提示神经元丢失是短暂的。新生儿感染导致成年期认知缺陷、神经炎症和海马神经发生改变。WT感染小鼠NOR探索比降低，海马Iba1、Il1β、Il6、Il10、Tnfα、Tlr4、S100b表达升高，齿状回Ki67⁺和双皮质素（doublecortin, DCX）⁺细胞增加，Nod1^ΔIEC小鼠无异常，表明IEC NOD1连接肠道感染与中枢神经免疫紊乱。早期EPEC感染导致持续的HPA轴激活和血清素信号改变。WT感染小鼠在P14和成年期回肠Tph2、Sert、5Htr2c、5Htr4表达升高，成年海马Tph2、Sert、5Htr2c升高；回肠和大脑Crfr2升高，海马Nos2和Gr升高，成年期血清皮质酮升高；Nod1^ΔIEC小鼠无此变化。益生菌胞壁肽补充减轻EPEC诱导的新生儿回肠病理和炎症。LC/MS鉴定出含M-Tri-Lys等多种单体、二聚体和三聚体胞壁肽；胞壁肽刺激脾细胞显著上调Il10；体内补充（10 μg/天，P7至P14）不改变EPEC定植，但阻断EPEC诱导的分泌状态和通透性增加，防止绒毛-隐窝轴缩短和Ki67⁺细胞减少，抑制细胞因子、PRR、趋化因子和Crfr2表达，恢复肌间神经元数量；回肠类器官实验表明NOD2抑制剂可消除胞壁肽的抗炎效应，提示其通过IEC NOD2发挥作用。

讨论总结：IEC NOD1是启动抗菌防御程序的关键介质，其缺失导致趋化因子信号受损、免疫细胞募集减少和病原体清除延迟；NOD1激活可放大炎症信号并导致持续性上皮功能障碍。血清素能和HPA轴改变提示神经内分泌通路的重编程。益生菌胞壁肽通过NOD2依赖性途径发挥宿主导向的免疫调节作用，限制未成熟肠道的炎症，具有预防早发肠道感染长期神经免疫后遗症的转化潜力。

研究结论：新生儿EPEC感染通过IEC NOD1介导的神经免疫途径导致MGB轴缺陷，而益生菌胞壁肽可通过NOD2激活对其进行有益调节；该研究凸显了NOD样受体在协调宿主神经免疫应答和驱动肠脑缺陷中的重要作用，并为儿科肠道细菌感染提供了潜在的治疗策略。