《Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology》：Proteomics of sperm duct and spermatophore from the ornate spiny lobster,
Panulirus ornatus: identifying the precursor of adipokinetic hormone/corazonin-like peptide (ACP)
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•通过蛋白质组学分析，在中段输精管和精荚中鉴定出了ACP前体的肽片段。•鉴定出了ACP前体片段潜在的抗氧化作用。•在输精管中鉴定出了与氧化应激和抗菌作用相关的肽。引言华丽锦绣龙虾（Panulirus ornatus）分布于印度-西太平洋热带水域（Yellapu等，2017），
• 通过蛋白质组学分析，在中段输精管和精荚中鉴定出了ACP前体的肽片段。
• 鉴定出了ACP前体片段潜在的抗氧化作用。
• 在输精管中鉴定出了与氧化应激和抗菌作用相关的肽。
引言 华丽锦绣龙虾（Panulirus ornatus ）分布于印度-西太平洋热带水域（Yellapu等，2017），包括托雷斯海峡和珊瑚海（Bell等，1987；Dennis等，2001；Dennis等，1998；Moore和MacFarlane，1984），对该地区的渔业和水产养殖业具有重要意义。此前，基于Ventura等（2020）构建的多组织转录组数据库，已对该物种多个组织产生的神经肽进行了转录组学分析。虽然大多数神经肽编码转录本主要在神经组织中表达，但某些肽类激素也在其他部位产生，如睾丸、卵巢、输卵管和输精管（Glendinning等，2023）。本研究重点关注脂肪动激素/心脏激素样肽（ACP），原因是该物种输精管中ACP 基因的表达量出乎意料地高。其他十足目的转录组学研究表明，ACP 主要在大脑、胸部神经节和眼柄中表达（Nguyen等，2016；Suwansa-ard等，2016），但很少有研究将输精管纳入分析范围。在红螯螯虾（Cherax quadricarinatus ）中，除眼柄外，还检测到触角腺中ACP 的微量表达（Nguyen等，2016）。在挪威海螯虾（Nephrops norvegicus ）中，ACP前体转录本在成熟卵巢中检出，在未成熟卵巢中也有一定程度的表达，同时在神经组织和成熟肝胰腺中也存在（Nguyen等，2018）。在锯缘青蟹（Scylla paramamosain ）中，ACP 主要在卵巢中表达，此外在眼柄、脑神经节和胸部神经节中也有较低水平的表达，通过qPCR检测还发现肠和Y器官中也有少量表达（Tan等，2024）。作者发现，与前期和黄体发生早期相比，后期黄体发生阶段神经组织和卵巢中ACP的表达量有所增加，并通过免疫组织化学方法将ACP肽定位于卵巢的卵泡细胞中，暗示其在雌蟹卵母细胞成熟过程中具有潜在功能。
ACP最早在昆虫中被鉴定（Hansen等，2010），属于促性腺激素释放激素（GnRH）超家族成员，与GnRH、心脏激素、脂肪动激素（AKH）和红褐色素集中激素（RPCH）同属一个超家族（Roch等，2011）。ACP的命名是因其与AKH和心脏激素具有结构相似性，然而这三种无脊椎动物肽在功能上各不相同，且在不同物种中可能具有不同的功能，如近期综述所述（Marco等，2024）。迄今仅在三个物种中考察了ACP在甲壳动物中的推测功能。在巨淡水虾（Macrobrachium rosenbergii ）中，注射ACP后卵母细胞增殖减少，注射ACP 30分钟后血淋巴中总脂质含量升高（从约0.8 mg/ml升至1.1 mg/ml）（Suwansa-ard等，2016）。在绿滑蟹（Carcinus maenas ）中，ACP处理并未引起血淋巴中葡萄糖或甘油三酯浓度、体色或心率的变化（Alexander等，2018），而这些功能在昆虫研究中归于AKH/RPCH神经肽家族（Marco和Gade，2020；Toprak，2020；Veenstra，1989）。在S. paramamosain 中，连续数周注射ACP（剂量为15 ng/g体重）导致生殖腺体指数和血淋巴中蜕皮酮浓度升高，表明ACP在该物种中通过黄体发生途径参与卵巢成熟（Tan等，2024）。
近期研究发现ACP与某些节肢动物物种的能量底物利用之间存在关联。在飞蝗（Locusta migratoria ）中，ACP似乎对长时间飞行是必需的，因其参与脂质代谢（Hou等，2021）；而在埃及伊蚊（Aedes aegypti ）中，ACP参与控制雌蚊的糖原浓度和雄蚊的海藻糖浓度（Afifi等，2023）。ACP的功能似乎具有高度的物种特异性，这在甲壳动物中很可能同样适用。
本研究的主要目的是通过蛋白质组学分析验证ACP前体肽在P. ornatus 雄性生殖系统中、特别是中段输精管中的存在，以确认我们之前的转录组学结果。利用功能实验阐明合成的ACP及其前体来源的其他肽是否具有作为抗菌剂或抗氧化剂保护生殖道和储存精子的作用。我们对中段输精管和精荚中肽组的功能分析揭示了ACP相关肽在华丽锦绣龙虾中的一些新颖功能。
片段摘要 组织学 从成熟的P. ornatus 雄性个体中分离出雄性生殖道中段，在Bouin氏固定液中固定过夜，然后用PBS冲洗，储存于澳大利亚昆士兰州阳光海岸大学（UniSC）的70%乙醇中，此前由海洋与极地研究所（IMAS）负责运输和储存。组织切成0.3 cm小块，按常规方法进行石蜡包埋。组织在PBS中浸泡，然后在梯度递增的
中段输精管的形态学 P. ornatus 的中段输精管（图1A）纵切后，可见管腔内存在环状结构（图1B）。经过包埋和切片后，这些环状结构被确认为含有精原细胞的囊泡，在纵切面（图1C）和横切面（图2A）上均可观察到。围绕上皮层的肌肉外层层可见，上皮层含有大量细胞核（图2A、B）。被染成粉红色的基质包绕
讨论 我们此前的研究表明，出乎意料的是，一个属于促性腺激素释放激素家族的神经肽基因ACP 在华丽锦绣龙虾的中段输精管中表达量特别高，因此需要对该神秘组织进行深入调查。P. ornatus 的中段输精管是与精子在精荚复合体中储存和运输相关的组织，具有独特的环状结构，类似于
CRediT作者贡献声明 Susan Glendinning： 数据整理、调查、撰写——初稿。Tianfang Wang： 数据整理、调查、方法学、撰写——审阅与编辑。Malin Olsson： 调查。Trong D. Tran： 调查、方法学、撰写——审阅与编辑。David McMillan： 方法学、撰写——审阅与编辑。Quinn P. Fitzgibbon： 经费获取、撰写——审阅与编辑。Gregory G. Smith： 经费获取、撰写——审阅与编辑。Tomer Ventura： 概念构思、数据
伦理声明 本研究遵循ARRIVE（动物研究：活体实验报告）指南进行。无需伦理委员会审批。在昆士兰州，甲壳动物相关实验无需伦理审批。
利益冲突声明 作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢 本研究由澳大利亚政府通过
澳大利亚研究委员会 （
http://www.arc.gov.au/ ）产业转型研究枢纽项目（项目编号 IH190100014）资助。本文所述观点仅代表作者，不一定代表澳大利亚政府或澳大利亚研究委员会的观点。
Susan Glendinning|Tianfang Wang|Malin Olsson|Trong D. Tran|David McMillan|Quinn P. Fitzgibbon|Gregory G. Smith|Tomer Ventura
