北马其顿传统生山羊奶白卤奶酪真菌多样性与生化特性的综合表征

《Food Bioscience》：Fungal diversity and biochemical traits of a traditional raw goat milk cheese from North Macedonia: an integrated characterization

　　

本研究对北马其顿一种以生山羊乳生产的传统白卤奶酪进行了综合表征，特别关注真菌多样性及其在奶酪加工和成熟过程中的动态变化。研究人员将培养依赖方法（culture-dependent）与高通量测序（high-throughput sequencing）相结合，并联合脂肪酸谱和挥发性物质谱分析；同时，对可培养酵母开展初步功能表征，并将黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1）作为补充的生乳安全参数进行评估。在成熟过程中，真菌群落发生显著变化，春季生产的奶酪中以德巴利氏酵母（Debaryomyces hansenii）为主导，而多数秋季样品中马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）占优势。其他真菌分类群，包括地霉属（Geotrichum spp.）、齐氏库茨曼酵母（Kurtzmaniella zeylanoides）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），进一步凸显了该奶酪生态系统的多样性。两个生产期间在脂质组成和挥发性物质谱方面也存在差异，其中春季样品呈现较高的单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）和多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）比例，而秋季生产的奶酪表现出更高的挥发性复杂性。对可培养酵母的初步表征揭示了酶活性和对模拟胃肠道条件耐受性存在物种及菌株依赖性差异。此外，黄曲霉毒素M1含量超过欧盟法规限量，凸显了与原材料相关的安全隐患。总体而言，该综合方法揭示了这一传统奶酪生产系统内显著的微生物和生化变异性，并为生山羊奶白卤奶酪的真菌生态学提供了新见解。鉴于实验设计，春季和秋季生产的奶酪之间的差异应解释为与生产期相关的变异性，而非广义季节性效应的证据。

传统生奶奶酪是复杂的微生物生态系统，其中真菌群落虽常被低估，但对凝乳成熟和风味形成具有重要贡献。白卤奶酪是巴尔干及中东地区传统的盐水成熟奶酪，多以羊奶为原料。北马其顿具有生产生山羊奶奶酪的悠久传统，但有关其真菌多样性和动态的知识仍十分有限。为此，研究人员以该国产自生山羊奶的传统白卤奶酪为对象，结合培养依赖与非培养方法、脂肪酸与挥发性物质谱分析、可培养酵母功能筛选以及黄曲霉毒素M1检测，对其真菌生态及生化特征进行综合表征，并选择春季和秋季两个生产期考察生产系统内的变异性。

研究人员从北马其顿泰托沃（Tetovo）地区塞尔采（Selce）村一个家庭式小规模乳品厂采集样本，使用本地混种山羊生乳制作白卤奶酪；春季和秋季各生产两个独立批次（S1/S2、A1/A2），生乳于奶酪制作前取样，奶酪在0、30、60天成熟期取样。主要技术方法包括：亲和柱荧光法测定黄曲霉毒素M1；索氏提取结合气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）分析脂肪酸甲酯；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）测定挥发性有机物；选择性培养基进行酵母和霉菌计数；通过26S rRNA基因D1-D2区高通量测序及QIIME2/DADA2流程分析真菌群落结构；对分离酵母经ITS区测序鉴定并进行胞外酶活性和模拟胃肠道耐受性测定。

### 3.1 生山羊乳中黄曲霉毒素M1检测
采用亲和柱荧光法测定生羊乳中的黄曲霉毒素M1。结果显示，春季和秋季生乳中该毒素含量分别为0.104±0.008和0.150±0.031 μg kg^-1，无显著生产期间差异，但均超过欧盟法规限量（0.050 μg kg^-1），提示原料乳存在安全风险。

### 3.2 乳和奶酪样品中的脂肪酸组成
通过GC-FID分析了生乳及成熟期奶酪的脂肪酸谱。所有样品以饱和脂肪酸（SFA）为主，棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和油酸（C18:1c）含量最高。春季乳的MUFA和PUFA比例高于秋季乳（春季乳MUFA 33.2%、PUFA 4.4%，秋季乳分别为23.4%、3.0%），而秋季乳SFA比例更高（73.6% vs 62.4%）。这些差异在奶酪成熟过程中基本保留。主成分分析（PCA）显示春季和秋季样品可根据脂肪酸组成明显区分。

### 3.3 真菌微生物群分析
#### 3.3.1 活菌计数
培养计数显示，生乳中酵母和霉菌数量在春季和秋季间无显著差异，酵母约3 Log cfu mL^-1，霉菌约1 Log cfu mL^-1。春季奶酪的酵母计数在成熟期间显著升高（t0约4 Log cfu g^-1，t60约6 Log cfu g^-1）；秋季奶酪则显著下降（t0约3 Log cfu g^-1，t30约1 Log cfu g^-1）。春季奶酪霉菌计数始终低于1 Log cfu g^-1，而秋季奶酪初期约2.4 Log cfu g^-1，随后波动。

#### 3.3.2 真菌组成
基于26S rRNA基因D1-D2区高通量测序，共分析1,448,088条序列，子囊菌门（Ascomycota）为优势门（相对丰度54.20%~99.93%）。春季奶酪在成熟过程中德巴利氏酵母（Debaryomyces hansenii）逐渐占