LhSiase1催化的糖苷转移反应：发掘燕窝碎片用于唾液酸寡糖合成的生物活性潜力

《Food Chemistry》：LhSiase1-catalyzed transglycosylation: unlocking the bioactive potential of bird's nest fragments for sialylated oligosaccharides synthesis

　　

摘要
人乳寡糖（HMOs）包含结构复杂多样的糖原阵列，其中 3'-唾液酸乳糖（3'-SL）是一种主要的生物活性唾液酸化寡糖。本研究表征了来自赫尔辛堡乳杆菌的一种新型唾液酸酶 LhSiase1，并将其应用于一步法水解 - 转糖基化过程，以从成本效益高的糖蛋白来源生产 3'-SL。LhSiase1 在 45 °C 和 pH 5.0 时表现出最佳活性，并显示出高效的转糖基化作用，其水解/转糖基化比率（RH/T）为 2.27，将酪蛋白糖巨肽（cGMP）中的唾液酸转化为 3'-SL，产量为 4.17 mg/mL。重要的是，它还将从食用燕窝碎片中高分子量唾液酸糖蛋白转化为 3'-SL，产量为 2.28 mg/mL，从而提高了它们的生物利用度和营养摄取潜力。此外，开发了一种实用的速溶粉剂配方，使加水后能够无需设备即可原位合成 3'-SL。这种即用型策略为生产用于改善人类健康的功能食品和营养保健品中生物活性 3'-SL 提供了一条可扩展的途径。

引言
人乳寡糖（HMOs）是人乳中仅次于乳糖和脂类的第三丰富功能成分（Stephan 等，2017）。人乳寡糖（HMOs）在母乳中的浓度约为 5–15 g/L（Bensimon & Lu，2024）。作为新生儿发育的“天然盾牌”，人乳寡糖（HMOs）不仅促进有益肠道细菌的生长，还提供直接抵抗病原感染的保护并增强免疫系统（Walsh 等，2020）。人乳寡糖（HMOs）包含超过 200 种独特的寡糖结构（Diego & J，2023）。这些寡糖主要分为三类：岩藻糖基化（35–50%）、唾液酸化（12–14%）和非岩藻糖基化中性寡糖（42–55%）（Smilowitz 等，2014）。

在各种人乳寡糖（HMOs）中，唾液酸化寡糖（例如 6'-唾液酸乳糖、二唾液酸乳糖 -N-四糖）特别值得关注，因为它们含有末端唾液酸，这是一种独特的糖分子。唾液酸化寡糖对新生儿健康至关重要，通过促进益生菌的生长和代谢、抑制病原体粘附和优化免疫功能，调节肠道微生物生态系统并预防新生儿疾病（Wang 等，2021）。研究表明，与健康婴儿的母亲相比，生长迟缓婴儿母亲的母乳中唾液酸化 HMOs 浓度显著更高（Charbonneau 等，2016）。此外，它们作为婴儿大脑和神经系统发育的“燃料”发挥着至关重要的作用，直接促进神经细胞的形成（Bing 等，2003）。

除了存在于人乳中，人乳寡糖（HMOs）通常不存在于其他哺乳动物物种的乳汁中，仅在牛奶中检测到微量（Gopal & Gill，2000）。近年来，某些功能寡糖，如半乳寡糖和果寡糖（Westerbeek 等，2011），已成功作为益生元添加到婴儿配方奶粉中。然而，由于唾液酸的独特结构和负电荷，其生理功能无法被其他寡糖完全模拟（Lars & Evelyn，2012）。因此，天然唾液酸化寡糖的人工合成已成为研究的焦点。

目前，生产唾液酸化寡糖的主要方法是化学合成和酶技术（Schelch 等，2020）。虽然化学合成允许大规模生产，但它涉及繁琐的步骤并产生许多副产物。一个重大挑战是唾液酸和糖链之间键（如 α2,3-或 α2,6-键）的精确构建（Adak 等，2013），这可能导致产品活性不足。近年来，酶合成因其高效和环保的特性而备受关注。使用唾液酸转移酶和唾液酸酶作为合成工具，为生产唾液酸化寡糖提供了一条有前景的途径（Yu & Withers，2015）。然而，通过唾液酸转移酶合成唾液酸化寡糖依赖于昂贵且不稳定的化合物 CMP-唾液酸作为底物，导致生产成本高（Endo 等，2000）。

唾液酸酶（神经氨酸酶，N-乙酰神经氨酸水解酶，EC 3.2.1.18）是一类糖苷水解酶，催化从各种唾液酸衍生物中移除唾液酸残基（Nag 等，2022）。此外，在适当条件下，这些酶的水解活性可以被抑制，使它们能够通过转糖基化催化糖苷键的形成（Lederkremer 等，2022）。与传统的唾液酸转移酶不同，具有转糖基化活性的唾液酸酶可以克服与 CMP-唾液酸供体依赖性相关的限制，通过直接利用天然糖缀合物（例如乳清蛋白、寡糖）中发现的唾液酸残基作为供体（Schelch 等，2020）。通过转糖基化反应，它们可以将这些残基精确转移到特定的受体（如乳糖）上（Zeuner, Jers, et al., 2014）。然而，天然唾液酸酶通常面临水解活性高、转糖基化效率低（低于 20%）和受体底物范围有限等挑战，这些共同阻碍了它们的工业应用。

燕窝是一种传统且珍贵的滋补品，由雨燕唾液中高浓度分泌的黏液糖蛋白组成（Ling 等，2022）。它含有唾液酸（Neu5Ac）（Nur‘Aliah 等，2021），这与体内源性唾液酸组成相匹配。完整的食用燕窝（EBN）在消费者中非常受欢迎，价格昂贵。加工燕窝产品通常含水量低，然而，约 10% 的燕窝在储存和运输过程中会破碎（Mohd 等，2022）。这些碎片不适合高级整燕窝产品，商业价值低，因此仍未得到充分利用（Ling & Jian，2023）。在可持续发展和资源增值的背景下，破碎燕窝的未充分利用引起了越来越多的研究兴趣，近年来出现了将其转化为高价值产品的探索性努力。Ling 等人研究了通过酶水解从低价值燕窝副产品中回收增值糖肽的可行性。结果显示，回收的糖肽具有增强的抗氧化活性，这有助于减少燕窝加工过程中的浪费并提高副产品的经济价值（Alvin 等，2020）。研究人员使用此类燕窝副产品作为原料，通过酶水解制备生物活性肽。优化水解过程后，所得产品的唾液酸含量为 7.04%，显示出显著的保湿效果，抑制了透明质酸酶和弹性蛋白酶活性，并有效防止和修复了皮肤细胞的氧化和炎症损伤（Zirui 等，2025）。尽管上述文献和工业举措共同推动了食用燕窝副产品的增值利用，但该领域的研究仍处于知识积累的相对早期阶段。特别是，基于系统的基础酶学研究和新型酶制剂开发的燕窝碎片增值转化方面的突破仍然稀缺。

食用燕窝碎片和边角料等副产品的营养成分与整燕窝相当；然而，它们所含的唾液酸主要以分子量超过 100 kDa 的糖蛋白结合形式存在（Zirui 等，2025）。这些结合缀合物的 macromolecular 性质限制了它们的消化和吸收，从而导致此类副产品流生物利用度低和未充分利用。虽然炖煮可以部分展开糖蛋白结构，但这些蛋白质上的唾液酸化糖链阻碍了消化酶介导的降解，损害了系统吸收（Ali 等，2025）。体外模拟消化实验表明，蛋白质结合唾液酸在体内的停留时间较长，但转化和吸收有限。相反，与寡糖或糖肽共轭的唾液酸显示出有利于吸收和利用的良好保留特性（Ramón 等，2011）。Dai 等人的进一步研究表明，加工参数包括炖煮温度、时间和固液比可以诱导蛋白质结合唾液酸转化为寡糖结合形式，从而提高其生物利用度（Yuwei 等，2021）。Ren 等人利用 Caco-2 细胞转运模型证实，较高的炖煮温度通过产生更高产量的低分子肽产物促进结合唾液酸的吸收（Ren 等，2026）。因此，与其蛋白质结合对应物相比，以寡糖或糖肽形式存在的唾液酸表现出更优越的体内吸收和利用。因此，将燕窝碎片中的唾液酸糖蛋白转化为唾液酸化寡糖具有双重益处：提高生物利用度并提升该工业副产品的经济价值。

本研究首次报道了来自赫尔辛堡乳杆菌的唾液酸酶（LhSiase1）的特征表征，并在大肠杆菌 BL21(DE3) 中进行了克隆和表达。在确认重组酶的分子量并完成生化表征后，确定了最佳酶促条件，以评估其从燕窝碎片合成唾液酸化寡糖（SOs）的能力。在优化条件下使用乳糖作为受体底物，LhSiase1 高效地将燕窝碎片中的唾液酸糖蛋白转化为 SOs，解决了天然糖蛋白生物利用度低的问题并提高了碎片利用率。这种酶策略不仅解锁了燕窝副产品的潜在营养价值，还通过开发强化 SOs 的功能食品推动工业创新。

片段
材料
乳糖，2-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N-乙酰神经氨酸（4MU-Neu5Ac），6'-唾液酸乳糖（6'-SL, Neu5Acα2?6Galβ1?4Glc），3'-唾液酸乳糖（3'-SL, Neu5Acα2?3Galβ1?4Glc），以及聚唾液酸（PSA, (Neu5Acα2-8Neu5Ac)n，平均分子量为 30 kDa），均购自阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。乳清蛋白购自麦兰（中国上海），酪蛋白糖巨肽 -20(cGMP) 购自 Arla（丹麦）。Tris, 咪唑，

LhSiase1 重组生产和纯化
在本研究中，一种来自赫尔辛堡乳杆菌的外切 α-唾液酸酶（命名为 LhSiase1）是从 NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）筛选出来的。基于保守的 GH33 催化结构域和推测的唾液酸酶活性位点残基（Asp/Arg/Tyr 三联体）的存在，该基因被选为具有转糖基化活性的有前景的候选者。密码子优化以在大肠杆菌中表达的 LhSiase1 编码序列经化学合成并克隆入该

结论
在本研究中，我们表征了来自赫尔辛堡乳杆菌的一种新型唾液酸酶 LhSiase1。该酶表现出独特且具有工业相关性的转糖基化主导特性，实现了 3'-唾液酸乳糖（3'-SL）的高效一步法合成。LhSiase1 实现了将 cGMP 中的唾液酸供体转化为浓度为 4.17 mg/mL 的 3'-SL。此外，这种生物催化过程通过转化唾液酸

CRediT 作者贡献声明
闫宇航：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，可视化，验证，监督，形式分析，数据整理，概念化。
牛一霖：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，方法学，调查，形式分析，数据整理，概念化。
宋亚音：写作 – 原稿，软件，方法学，调查，形式分析，数据整理。
张宇：软件，项目管理，方法学，调查。
吴子昂：

资助
本研究由北京市自然科学基金（项目编号 6262002）和中国国家自然科学基金（项目编号 32072199 和 32201944）资助。还获得了北京工商大学青年学者研究基金（项目编号 RFYS2025）的支持。

利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

闫宇航|牛一霖|宋亚音|张宇|吴子昂|陈伟|陈洲|贾应敏|李思婷|马艾进|刘雪强|刘乙豪