《Food Chemistry: X》：Purification, sequence identification, and taste-presenting mechanism analysis of four novel taste-active peptides enzymatically prepared from shiitake mushroom (
Lentinula edodes)
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研究人员获得了四种具有良好呈味效果的新型肽；四种肽与异二聚体鲜味受体T1R1/T1R3（由T1R1和T1R3亚基组成的味觉受体）结合强烈且稳定；通过电子舌（e-tongue）验证了合成肽的良好呈味活性；揭示了其在功能性调味产品中的巨大应用潜力。
研究人员获得了四种具有良好呈味效果的新型肽；四种肽与异二聚体鲜味受体T1R1/T1R3（由T1R1和T1R3亚基组成的味觉受体）结合强烈且稳定；通过电子舌（e-tongue）验证了合成肽的良好呈味活性；揭示了其在功能性调味产品中的巨大应用潜力。
香菇（Lentinula edodes）是我国传统食用菌，因独特风味和丰富营养而广受喜爱，其蛋白质含量高，富含谷氨酸和天冬氨酸等呈味氨基酸，是发掘天然呈味肽的理想来源。近年来，随着消费者对天然健康调味品需求的增长，从食用菌中分离鉴定具有明确呈味活性的肽已成为食品风味与添加剂研究的重要方向。鲜味和咸味是两类基本味觉属性，在协调和增强食品整体风味中发挥关键作用。鲜味肽不仅能直接贡献鲜味感知，还能提升风味复杂度和延长味道持久性；咸味肽则可替代或部分替代食盐，有助于开发更健康低钠食品。目前国内外在食用菌鲜味肽研究方面已取得一定进展，例如从干香菇中鉴定出多种鲜味肽，从白玉菇（Hypsizygus marmoreus）中分离出六种具有显著增鲜效果的鲜味肽。然而，以往研究多集中于常见食用菌物种，对香菇中呈味肽的系统性研究仍较有限，尤其是从这一资源中分离、鉴定和功能分析咸味肽的研究十分匮乏。传统呈味肽筛选和感官评价虽能直接反映人类味觉感知，但易受评定员个体差异、环境条件、生理状态和心理疲劳等多重混杂因素影响，损害结果的重复性和客观性。为克服这些局限，电子舌技术应运而生，并已广泛应用于酒类、茶、香菇及其他食用菌和水产品等的滋味评价，展现出良好的稳定性和重现性。将电子舌与人工感官评价结合，构建“仪器-感官”协同评价体系，可弥补传统方法的主观性和不稳定性，并通过仪器数据实现滋味轮廓的定量表征，使呈味化合物筛选和评价更加精准高效。基于前期优化的酶解工艺条件制备的粗肽液，本研究旨在通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统筛选和鉴定新型鲜味肽与咸味肽，进行电子舌感官评价，并通过肽合成验证呈味活性。该工作为香菇呈味肽资源开发和风味分析提供了系统方法，也为食用菌来源天然呈味肽的开发利用提供了理论基础。
研究人员采用超声波辅助碱提酸沉法提取香菇蛋白，经Flavourzyme酶解（响应面法优化条件：加酶量2060 U/g，温度49 °C，pH 7.0，水解94 min，肽得率80.6%），酶解液依次经D001大孔吸附树脂、Sephadex G-100凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）逐步纯化。感官评价小组由10名健康评定员（22-28岁，男女比例1:1）组成，培训后采用10点标度对样品的甜、酸、咸、鲜、苦味进行评分，每个样品由所有评定员重复评价三次。通过LC-MS/MS结合从头测序（de novo sequencing）鉴定肽序列，并使用NCBI BLASTp、ToxinPred、AllerCatPro 2.0、PepDraw、Innovagen及多个鲜味预测工具进行序列新颖性、毒性、致敏性、理化性质和鲜味潜力预测。利用SWISS-MODEL同源建模构建T1R1/T1R3异二聚体胞外捕蝇草结构域（VFT）模型，采用Autodock Vina进行分子对接分析结合能和相互作用力。最终将筛选出的肽进行固相合成，通过电子舌和感官评价验证其呈味活性。
3.1 分离纯化与筛选：经Sephadex G-100凝胶过滤获得A1和A2两个洗脱峰，感官评价显示A2组分的鲜味和咸味评分均高于6，显著优于A1，故选取A2进行RP-HPLC分离，得到A2-1和A2-2两个亚组分，电子舌分析显示二者呈味特性存在差异。
3.2 感官评价与电子舌验证：D001树脂和Sephadex G-100串联纯化后，电子舌和感官评价均表明苦味信号被有效抑制，鲜味和咸味得到保留并增强，其中鲜味评分从6升至8，咸味评分从6升至7，酸味和苦味降低，甜味略有增加，说明该纯化策略可富集鲜味和咸味低分子量肽并去除苦味相关成分。
3.3 肽序列鉴定：对RP-HPLC的A2-2组分进行LC-MS/MS分析，获得123个从头测序评分≥95的肽，经数据库筛选和分子对接综合评价，最终得到四个新型潜在鲜味肽PDDER、QPEEQDER、SPDDER和WEPGPQ。序列长度5-8个氨基酸，均富含天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）等酸性残基，BLASTp确认未被报道过。
3.4 同源建模：构建的T1R1/T1R3异二聚体VFT结构域模型呈典型双叶结构，Ramachandran图显示92.0%残基位于最favored区域，99.9%残基在合理范围内，证明模型立体化学合理，可用于分子对接。
3.5 分子对接：四个肽与T1R1/T1R3受体的结合能为-9.1至-11.2 kcal/mol，其中WEPGPQ结合能最低（-11.2 kcal/mol），亲和力最强。四种肽主要通过氢键与受体VFT结构域中的氨基酸残基相互作用，氢键长度1.8-2.9 ?，结合稳定；WEPGPQ还通过静电和π-阳离子等非氢键作用补偿了氢键数量不足，从而获得最低结合能。
3.6 合成肽的呈味活性验证：电子舌分析显示四种合成肽在鲜味传感器上均呈明显正响应（响应值8.44-9.68），其中SPDDER鲜味响应最高（9.68），且PDDER和SPDDER在咸味传感器上也呈较高响应（8.67和8.54）。感官评价进一步确认SPDDER鲜味评分达9.5、咸味评分达8.5，与电子舌结果高度一致。四种肽均预测无毒、无致敏，水溶性良好。
讨论部分指出，香菇蛋白过敏原性低，适合开发清洁标签产品；单酶（Flavourzyme）水解体系在工业化生产中更经济且重复性好；过度的水解程度会破坏活性肽片段，因此需精确控制水解条件。分子对接说明短链肽（2-8个氨基酸）才能进入T1R1/T1R3受体口袋，本研究四个肽符合这一构效关系。SPDDER因富含酸性氨基酸和精氨酸残基，同时表现出强鲜味和成味活性，推测精氨酸胍基可与上皮钠通道（ENaC）等盐味受体相互作用，具有作为“鲜咸双味”肽的开发潜力。研究也存在局限：安全性预测基于计算机工具，需实验验证；电子舌评价需与谷氨酸钠和氯化钠阳性对照比较；受咸味肽研究不足和咸味受体认知限制，肽的成味机制尚未深入探索。
研究结论：通过三步分离纯化结合质谱鉴定，从香菇蛋白水解物中获得四种新型呈味肽PDDER、QPEEQDER、SPDDER和WEPGPQ。分子对接显示四种肽均能与鲜味受体T1R1/T1R3的VFT结构域形成氢键相互作用，具有良好受体结合亲和力。合成肽的感官评价和电子舌分析证实它们具有明显的鲜味活性，并兼具成味贡献。其中SPDDER表现最为突出，电子舌响应值鲜味9.68、咸味8.54，感官评分鲜味9.5、咸味8.5。因此，本研究制备的香菇源肽有潜力开发为新型减盐增鲜调味品。
