《Food Chemistry: X》：Stage-dependent microbial succession and metabolite profiles of
Phyllanthus emblica L. fruit wines produced under different temperature and pomace treatments
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专业摘要翻译：发酵阶段和处理方式重塑了余甘子（Phyllanthus emblica L.）果酒的微生物群落。研究人员采用细菌16S rRNA基因和真菌ITS扩增子测序、HS-SPME–GC–MS及非靶向UHPLC–QTOF–MS代谢组学方法，对20?°C果汁
专业摘要翻译：发酵阶段和处理方式重塑了余甘子（Phyllanthus emblica L.）果酒的微生物群落。研究人员采用细菌16S rRNA基因和真菌ITS扩增子测序、HS-SPME–GC–MS及非靶向UHPLC–QTOF–MS代谢组学方法，对20?°C果汁酒（FW）、20?°C含果渣果汁酒（PW）及26?°C果汁酒（CK）在发酵早、中、后期进行了系统表征。结果表明，Saccharomyces在真菌群落中占主导地位，而Gluconobacter在PW中期短暂富集。果渣添加在20?°C条件下改变了各发酵阶段的非挥发性代谢物谱，FW与PW在20?°C下的挥发性特征组成比例存在差异。微生物与代谢物之间的关联呈现阶段依赖性，但仅属探索性统计关联。研究强调，DNA扩增子测序无法区分存活细胞与残留DNA，微生物–代谢物相关性应视为统计关联而非代谢功能的直接证据。
论文解读文章
一、研究背景与问题
余甘子（Phyllanthus emblica L.）又名印度醋栗，是热带和亚热带亚洲广泛种植和加工的可食用水果，富含抗坏血酸和酚类成分，包括鞣质、酚酸和黄酮类化合物，这些成分赋予其抗氧化特性。然而，这些成分连同果实的高有机酸含量，也导致其具有明显的酸味、苦味和涩味。尽管这些成分特性支持其开发为高附加值饮品，但过度的酸度和涩味可能限制消费者的接受度。因此，需要通过加工和发酵策略来调节这些感官特性，同时保留果实的独特成分。
酒精发酵是使水果产品多样化的有效途径。在发酵过程中，接种的Saccharomyces cerevisiae将可发酵糖转化为乙醇，并产生有助于风味的次级代谢产物。然而，初始有机酸和酚类谱主要由原料果实基质决定，并可能通过提取、氧化、聚合、沉淀、酯化和微生物转化而被修饰。温度可以影响酵母生长及碳氮相关代谢，从而改变挥发性和非挥发性代谢产物的形成和相对分布。果渣是果汁加工中未被充分利用的副产物，保留了膳食纤维、酚类成分、有机酸、残留糖等成分，可能作为有价值的食品配料和发酵基质。
此前研究已建立了余甘子果酒低温发酵工艺，但未系统研究阶段依赖性微生物演替及其与挥发性、非挥发性代谢物变化的关联。本研究旨在填补这一空白，通过多组学整合分析揭示温度与果渣处理对微生物群落和代谢物谱的协同影响。
二、研究设计与主要结论
研究人员设置了三种处理：20?°C发酵的果汁酒（FW）、20?°C发酵的含果渣果汁酒（PW，湿果渣与果汁比例1:5 w/w）以及26?°C发酵的果汁酒（CK，常规温度对照）。在发酵早期（第0天）、中期（FW第10天、PW第5天、CK第6天）和后期（FW第15天、PW第13天、CK第11天）进行破坏性取样，共获得27个瓶级发酵重复样本。
研究得出以下主要结论：第一，发酵阶段和处理方式显著重塑了细菌和真菌群落组成，Saccharomyces在真菌群落中占主导地位，Gluconobacter在PW中期短暂富集至81.84%的相对丰度；第二，果渣添加在20?°C条件下改变了各发酵阶段的非挥发性代谢物谱，40个注释差异特征在三个阶段比较中共享；第三，FW与PW在20?°C下挥发性特征组成比例存在差异，尤其是醚类化合物在PW中占比显著更高（22.98%对6.90%）；第四，微生物–代谢物关联呈现阶段依赖性，但仅属探索性统计关联。
三、关键技术方法
本研究采用了以下核心技术手段：细菌16S rRNA基因和真菌ITS扩增子PacBio测序用于微生物群落组成分析；HS-SPME–GC–MS用于挥发性风味谱表征；非靶向UHPLC–QTOF–MS代谢组学用于非挥发性代谢物分析。样本来源于云南省红河哈尼族彝族自治州石屏县采购的新鲜余甘子果实。所有27个样本均纳入各分析。生物信息学分析使用QIIME 2、R及BMKCloud平台完成。
四、研究结果
（一）发酵过程中余甘子果酒微生物群落的阶段相关变化
细菌和真菌特征累积曲线接近渐近线，表明当前样本集捕获了数据集中大部分可检测群落特征。花瓣图显示279个细菌OTU和6个真菌OTU在所有九个处理–阶段组合中共享。在门水平，变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）主导细菌群落，合计占所有样本相对丰度的69%以上。子囊菌门（Ascomycota）在所有处理中占主导地位，相对丰度超过57%。在属水平，Paucibacter在EF和EP中占主导地位，分别占细菌序列的79.14%和77.18%；Gluconobacter在MP中达到81.84%的相对丰度；Saccharomyces在大多数样本中为优势真菌属。PCA分析显示细菌群落PC1和PC2累计解释99.23%的变异，真菌群落累计解释95.89%。PERMANOVA和ANOSIM均证实九个处理–阶段组合间存在显著差异（细菌ANOSIM R=1.000，真菌ANOSIM R=0.967，均P=0.001）。LEfSe分析鉴定出阶段相关的判别性分类群：Paucibacter和伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）与EF相关，Gluconobacter和醋杆菌科（Acetobacteraceae）表征MP，乳杆菌目（Lactobacillales）和Streptococcus为MC的判别分类群，Bacteroides和颤螺菌目（Oscillospirales）主要与LP相关。
（二）余甘子果酒发酵过程中非挥发性代谢物谱
非靶向UHPLC–QTOF–MS分析在FW和PW样本中生成3964个对齐的LC–MS离子特征，其中2936个获得推定代谢物注释。注释特征包括有机酸及相关化合物（1425个）、糖类及其衍生物（622个）、脂肪酸及相关脂质（426个）、氨基酸及其衍生物（403个）、醇类相关类别（38个）和酚类化合物（22个）。糖类相关信号在早期阶段普遍较高，中后期较低。有机酸、氨基酸、脂质和酚类相关特征在FW和PW间存在差异，表明在相同发酵温度20?°C下存在果渣相关变异。注释特征映射到47条KEGG通路，主要类别包括氨基酸、碳水化合物、脂质、辅因子和维生素以及次级代谢物代谢。三个阶段比较（EP对EF、MP对MF、LP对LF）共享40个注释差异特征，MP对MF包含最多的比较特异性特征。KEGG富集模式随发酵阶段变化：早期比较包括叶酸介导的一碳池和类黄酮生物合成通路，中期和后期比较包括核黄素代谢、β-丙氨酸代谢、碳水化合物和氨基酸相关通路及次级代谢物生物合成。
（三）终期余甘子果酒的挥发性风味谱
HS-SPME–GC–MS分析在终期FW和PW合并数据集中获得256个推定注释挥发性特征，其中249个为两处理共享，6个仅在FW中检测到，1个仅在PW中检测到。经排除内标峰、背景污染物、分析伪影和化学上不合理的库匹配后，242个保留挥发性特征纳入组成分析。醇类构成两处理中最大的化学类别，分别占FW和PW谱的39.15±0.88%和30.28±0.95%。酯类在FW中占12.27±0.29%，在PW中占10.50±0.43%。醚类在PW中的比例远高于FW（22.98±0.83%对6.90±0.20%），其中苯（2-甲氧基乙基）为主要贡献者（PW中22.76%对FW中6.67%）。醛类在FW和PW中占相似比例，酮类、酸类、酚类和其他化合物在两种谱中占较小比例。
五、讨论与结论总结
讨论部分强调，DNA扩增子测序无法区分存活和代谢活跃的微生物与失活细胞或残留DNA，因此微生物–代谢物相关性应解释为统计关联而非微生物产生、通路激活或代谢调控的直接证据。实验设计未包含26?°C发酵的含果渣处理，因此无法分离发酵温度和果渣添加的独立效应。代谢物注释主要基于精确质量、理论碎片和数据库匹配，属于推定注释而非确定鉴定，注释不确定性是未靶向代谢组学的重要局限。研究结论指出，发酵阶段和处理方式显著重塑了余甘子果酒的微生物群落和代谢物谱，果渣添加在20?°C下引起阶段依赖性的非挥发性代谢物差异，FW与PW在挥发性特征组成比例上存在差异，微生物–代谢物关联呈阶段依赖性且属探索性。这些发现为理解余甘子果酒发酵过程中微生物演替与代谢物变化的关联提供了基础数据，但因果关系的建立仍需菌株分离和受控发酵验证。
