《Biologicals》：Development and validation of a quantitative real-time PCR method for determination of residual host DNA in recombinant human C1 esterase inhibitor (rhC1INH)
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摘要本研究建立并验证了一种基于定量实时聚合酶链反应（qPCR）的方法，用于检测重组人C1酯酶抑制剂（rhC1INH）中的残留宿主DNA。rhC1INH是一种通过转基因兔乳腺表达的生物技术药物。使用基于碘化钠的提取试剂盒从rhC1INH样品中提取DNA，并优化了针对兔特异性L1
摘要
本研究建立并验证了一种基于定量实时聚合酶链反应（qPCR）的方法，用于检测重组人C1酯酶抑制剂（rhC1INH）中的残留宿主DNA。rhC1INH是一种通过转基因兔乳腺表达的生物技术药物。使用基于碘化钠的提取试剂盒从rhC1INH样品中提取DNA，并优化了针对兔特异性L1Oc基因的TaqMan qPCR检测方法，对其特异性、线性范围、定量下限（LOQ）、准确性、精密度和稳健性进行了评估。该方法表现出高度的物种特异性，对人或其他常见哺乳动物DNA无交叉反应。其宽动态范围为0.001–100 pg/μL，标准曲线线性关系优异（R2 > 0.99），扩增效率为90–110%。LOQ为0.001 pg/μL，满足痕量DNA检测的灵敏度要求。加标回收实验验证了良好的定量准确性，在低、中、高浓度水平的回收率范围为71.83%至97.26%。评估了批内和批间精密度，在所有测试浓度下相对标准偏差（RSD）不超过15.42%，证实了良好的方法重复性。通过考察不同试剂批号和裂解温度变化对结果的影响来验证方法稳健性，所有相应指标的RSD值均不超过30%。该qPCR方法具有高特异性、高灵敏度和操作便捷等特点，可作为rhC1INH及其他转基因兔乳腺来源生物技术药物质量控制的可靠技术手段。
引言
生物制药，如重组蛋白、单克隆抗体和疫苗的生物制造，不可避免地会产生宿主细胞来源的污染物，被归类为典型的工艺相关杂质。残留宿主细胞DNA对药物的安全性和治疗效果构成潜在威胁，因此受到全球监管机构的广泛关注[[1]、[2]、[3]]。世界卫生组织（WHO）、欧洲联盟（EU）、美国食品药品监督管理局（FDA）以及中国国家药品监督管理局（NMPA）等主要监管机构，均已对生物制品中的残留宿主细胞DNA制定了严格的监管规范。一般来说，疫苗中残留DNA的允许限值为每剂≤100 pg，而高剂量重组蛋白和单克隆抗体制剂则适用更严格的每剂≤10 ng的上限值[[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]]。
重组人C1酯酶抑制剂（rhC1INH）是中国通过转基因动物技术制造的具有创新性的治疗候选药物之一，目前正处于临床研究阶段。该蛋白通过转基因兔乳腺生物反应器生产，这是一种前景广阔的表达平台，具有高重组蛋白产量、简化的纯化流程、成本效益高以及类人糖基化特征等优点。这些有利特性确保了重组蛋白的准确翻译后修饰和稳定的治疗性能[[10]、[11]、[12]、[13]]。在特定病原体-free（SPF）屏障饲养条件下饲养的兔完全符合良好生产规范（GMP）标准，具有繁殖周期短、生物安全等级高和饲养成本低等固有优势。此外，已成功获得临床应用的鲁康杰?（Ruconest?）——一种获批用于治疗急性遗传性血管性水肿的兔源C1酯酶抑制剂——进一步证明了该转基因平台的可靠性和转化潜力[14]。
尽管兔乳腺表达系统具有多重优势，但在整个生产过程中对残留兔宿主细胞DNA的监控仍然是一个至关重要的未解决技术难题。传统的DNA检测技术，包括DNA探针杂交和荧光染色，受到检测灵敏度低、实验程序耗时和操作流程繁琐的制约。相比之下，定量实时聚合酶链反应（qPCR）凭借其卓越的灵敏度、快速的检测周转时间和与标准化药品质量控制系统良好的兼容性，已成为残留宿主细胞DNA定量的金标准[[15]、[16]、[17]、[18]、[19]]。选择合适的基因靶标对于qPCR检测的可靠性能至关重要，监管指南优先考虑多拷贝和物种特异性的重复序列，以最大化检测灵敏度[7,20]。作为长散在核元件（LINE）家族成员，兔源L1Oc序列广泛分布于兔基因组中，是物种特异性qPCR检测的理想扩增靶标[10]。然而，目前尚无经过全面验证的qPCR检测方法用于兔源生物技术药物中残留兔宿主细胞DNA的定量检测。
本研究根据中国药典（2025年版）通则9012，建立并验证了一种针对兔L1Oc-1序列134 bp片段的TaqMan qPCR检测方法。该方法LOQ为0.001 pg/μL，能够灵敏且特异性地检测rhC1INH产品中残留的兔宿主细胞DNA，为兔源生物技术药物的质量控制提供了可靠工具。
分节摘录
细胞系和实验动物
所有细胞系，包括293T（人胚胎肾细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）、MRC-5（人胎儿肺成纤维细胞）、MDBK（Madin-Darby牛肾细胞）、ST（猪睾丸细胞）和PG-4（猫胎儿脑星形胶质细胞），以及大肠杆菌JM109，均由成都生物制品研究所有限责任公司维护和传代。特定病原体-free（SPF）小鼠和兔也由同一研究所饲养和管理。
检测方法的建立
建立了高度线性的标准曲线（y = ?3.438x + 24.757）用于残留DNA的定量，测定系数（R2）为0.999，表现出优异的线性关系（图1）。如表1所示，在四种浓度（0.5、0.2、0.05和0.005 pg/μL）下加标的rhC1INH测试样品的平均回收率范围为75.75%至86.00%，相对标准偏差（RSD）在1.12%至5.52%之间，均满足预设的接受标准。
Ct
讨论
为降低感染性和致癌性风险，国际监管机构已建立了双重安全阈值：总残留限值为每剂10 ng，更为关键的是片段大小限值为<200 bp[[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]]。本研究首次提出了一种经过全面验证的qPCR检测方法，靶向高拷贝数L1Oc-1元件用于检测rhC1INH中残留的兔DNA。该方法严格按照中国药典（2025年版）、ICH Q2(R2)和MIQE
CRediT作者贡献声明
Cong Cong：撰写——初稿，可视化，验证，调查，形式化分析。Xiaoping Yu：验证，调查。Tianfei Du：撰写——审稿与编辑。Yali Gao：调查。Jiayao Tian：调查。Chunyang Li：撰写——审稿与编辑，项目管理，方法论，概念构思。Lanjun Liu：项目管理，方法论，概念构思。
伦理声明
本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南以及以下动物福利和/或报告指南进行：成都生物制品研究所有限责任公司实验动物福利法规/动物护理和使用指南。本研究已获得成都生物制品研究所有限责任公司动物福利与伦理委员会的批准（批准号：LALL-2024-P016）。
利益冲突声明
作者声明不存在任何财务或非财务利益冲突。所有作者均已审阅并批准所提交的手稿，并同意作者署名顺序。本工作未在其他地方发表，也未在其他期刊审稿中。
本研究未获得任何资金资助。数据可应合理要求向通讯作者索取。本研究不涉及人体或动物受试者。
在准备本手稿过程中未使用生成式人工智能工具。所有作者
Cong Cong|Xiaoping Yu|Tianfei Du|Yali Gao|Jiayao Tian|Chunyang Li|Lanjun Liu
