《Molecular Pain》：Differential expression of μ-, δ-, and κ-opioid receptors in muscle afferents from male and female rats
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摘要：小直径无髓鞘（group IV）和有髓鞘（group III）肌肉传入神经通过传导动作电位来传递肌肉疼痛信号和运动加压反射（EPR）。EPR有助于驱动运动过程中的心血管反应。已有研究表明，μ-（μOR）、δ-（δOR）和κ-（κOR）阿片受体（OR）在背
摘要：小直径无髓鞘（group IV）和有髓鞘（group III）肌肉传入神经通过传导动作电位来传递肌肉疼痛信号和运动加压反射（EPR）。EPR有助于驱动运动过程中的心血管反应。已有研究表明，μ-（μOR）、δ-（δOR）和κ-（κOR）阿片受体（OR）在背根神经节（DRG）神经元中均有表达，但只有外周μOR的激活被证实能够抑制由group IV传入神经介导的EPR。为确定这一现象是否源于OR的差异表达，研究人员识别了雄性和雌性大鼠DRG中的group IV神经元以及腓肠肌中的轴突，并采用免疫细胞化学方法比较了μOR、δOR和κOR的表达情况。结果显示，相较于δOR或κOR，μOR标记在group IV胞体和轴突中更为常见。轴突上的OR标记低于胞体，尤其是δOR和κOR。雄性动物与雌性动物之间的OR染色未见显著差异。μOR轴突表达的相对较高水平表明，μOR被选择性转运至外周group IV轴突，这可以解释μOR激动剂为何能选择性抑制产生EPR和肌肉疼痛的group IV传入神经活动。
研究背景与科学问题
运动过程中，骨骼肌需增加葡萄糖和氧气的供应以维持收缩强度，此时会激活运动加压反射（Exercise Pressor Reflex, EPR），通过增强交感神经输出来提高心率和血压，从而满足代谢需求。EPR主要由小直径有髓鞘（group III）和无髓鞘（group IV）传入神经纤维激活，其中group III纤维主要响应机械刺激，而group IV纤维则主要被缺血肌肉释放的物质（如缓激肽、前列腺素、乳酸）所激活。这些相同的物质在外周动脉疾病导致的肌肉缺血中也同样会触发EPR和间歇性跛行等肌肉疼痛。
阿片类药物长期以来被用于控制疼痛，主要通过三种受体发挥作用：μ-阿片受体（μOR）、δ-阿片受体（δOR）和κ-阿片受体（κOR）。以往研究多集中于中枢神经系统中的阿片受体，但近年发现外周感觉轴突上也存在这些受体，并在阿片诱导的镇痛中发挥作用。更重要的是，研究发现阿片类药物也能抑制EPR，但不同阿片受体亚型的选择性激动剂效果存在差异：外周μOR和δOR的激活可抑制EPR，但仅有脊髓κOR激动剂能降低肌肉收缩的升压效应；此外，δOR似乎优先抑制group III介导的EPR成分，而μOR则同时抑制group III和group IV介导的成分。这些功能差异强烈提示，不同类型的阿片受体在肌肉传入神经纤维上的表达模式可能存在差异。然而，尽管已知所有三种OR均在大鼠DRG的小到中型神经元中表达，但为何μOR的激活对group IV介导的EPR具有选择性抑制作用尚不清楚。因此，本研究旨在系统比较三种阿片受体在group IV肌肉传入神经胞体和外周轴突中的表达分布，并考察是否存在性别差异。
研究内容与主要结论
为解答上述问题，研究人员利用逆行示踪剂DiI结合免疫组织化学技术，系统分析了雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠的L4和L5背根神经节（DRG）中肌肉传入神经元以及腓肠肌（GM）内神经纤维上μOR、δOR和κOR的表达情况。研究得出以下核心结论：在group IV传入神经胞体中，绝大多数（约91%）表达μOR，而δOR和κOR的阳性率分别为约67%和约44%；但在外周轴突层面，μOR的阳性率高达约67%，而δOR和κOR的阳性率均低于20%。这表明虽然group IV胞体能合成所有三种阿片受体，但只有μOR被高效地转运至外周轴突末端，而δOR和κOR的轴突定位则极为有限。这种差异性的轴突表达模式恰好可以解释为何μOR激动剂能选择性地抑制由group IV传入神经介导的EPR和肌肉疼痛。此外，研究未在雄性和雌性大鼠间观察到任何阿片受体在group IV传入神经胞体或轴突表达上的显著差异。
关键技术与方法
研究人员采用了以下主要关键技术方法：1）逆行神经示踪：向成年Sprague-Dawley大鼠（雌性250-450g，雄性450-650g）的双侧腓肠肌注射荧光染料DiI（1,1-dioctadecyl-3,3,30,30-tetramethylindocarbocyanine perchlorate），经7-14天运输后，在L4和L5背根神经节中特异性标记肌肉传入神经元的胞体；2）多重免疫荧光染色：使用鸡抗peripherin抗体（标记无髓鞘group IV神经元和轴突）结合兔抗μOR、δOR（分别靶向胞外N端和胞内C端两种表位）或κOR抗体进行共染，并通过相应的荧光二抗进行可视化；3）定量图像分析：利用ImageJ软件测量荧光强度和细胞面积，设定阈值判定阳性染色，统计peripherin和DiI双阳性的group IV胞体以及peripherin阳性轴突中OR阳性比例；4）统计学分析：采用Student's t检验比较两组数据，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey HSD事后检验，显著性水平设为P<0.05。
研究结果详述
μOR在雄性大鼠肌肉传入纤维和胞体中的表达
研究人员首先验证了μOR激动剂DAMGO可通过外周μOR抑制EPR的既往发现。在雄性大鼠腓肠肌切片中，大多数peripherin阳性的group IV神经纤维呈μOR阳性（67±24%）。同时，几乎所有DiI和peripherin双阳性的group IV胞体（91±8%）均被μOR抗体染色，这与前人报道一致。此外，μOR抗体还标记了血管壁，可能反映了血管平滑肌上的μOR表达。作为对照，研究人员估算了putative group III神经元（直径30-40μm且peripherin阴性）的μOR阳性率，仅为47±3%，显著低于group IV。
δOR和κOR在雄性大鼠group IV传入神经中的表达
相比之下，雄性大鼠group IV胞体中δOR阳性率为67±21%，κOR阳性率则为44±5%。为了排除δOR抗体特异性的争议，研究人员使用了靶向胞内C端表位的第二种δOR抗体（δOR-C），其标记的group IV神经元比例为47±9%，与原δOR抗体（靶向胞外N端）的结果无显著差异，因此将两者数据合并分析。统计学检验显示，μOR对group IV胞体的染色率显著高于δOR和κOR，也显著高于任何一种OR对putative group III胞体的染色率。然而，出乎意料的是，尽管group IV胞体中有40-60%表达δOR和κOR，但外周轴突中仅有15±4%的group IV纤维呈δOR阳性，19±27%呈κOR阳性，两者均显著低于μOR的轴突阳性率。
雌性大鼠group IV传入神经中的OR表达
鉴于EPR和阿片药物使用中存在性别差异的报告，研究人员在雌性大鼠中重复了上述实验。结果显示，雌性大鼠group IV胞体和轴突中各阿片受体的阳性率与雄性大鼠相比均无统计学差异。雌性大鼠group IV胞体中μOR阳性率为88±7%，δOR为50±14%，κOR为65±20%；轴突中μOR阳性率为65±8%，δOR为19±14%，κOR为20±10%。无论雌雄，μOR在group IV轴突中的表达均显著高于δOR和κOR。
讨论与结论总结
本研究的核心发现是：在健康大鼠的group IV肌肉传入神经中，胞体虽能合成所有三种阿片受体，但μOR是主要表达类型，并且在雌雄两性中均被优先转运至外周轴突（约65-67%轴突表达），而δOR和κOR的轴突定位则极为受限（<20%）。这一表达谱可以很好地解释功能性研究中的观察结果：即μOR激动剂能选择性抑制group IV介导的EPR和肌肉疼痛，而外周κOR激动剂无效，δOR激动剂的作用则主要局限于group III传入神经。
讨论部分进一步指出，该结果与其他关于大鼠DRG神经元中μOR mRNA丰度远高于δOR和κOR的研究相一致。研究还对比了皮肤传入神经的数据，发现皮肤无髓鞘轴突中δOR阳性率（约38%）远高于本研究中肌肉传入神经的δOR阳性率（约15%），这提示不同靶组织（肌肉 vs. 皮肤）的传入神经可能受到不同的生长因子调节，从而导致阿片受体表达的差异性调控。
在临床意义方面，本研究建立的健康基线对于理解外周动脉疾病（PAD）等病理状态至关重要。已有研究表明，在慢性肌肉缺血模型中，外周μOR激动剂的效力增强，而δOR和κOR激动剂也从无效变为有效。这说明在疾病状态下，阿片受体的表面表达或下游信号通路会发生上调，例如δOR的表面表达具有活性依赖性，可能通过内含致密核心囊泡与质膜融合来实现。本研究提供的基线数据为未来探索这些病理条件下的受体可塑性变化奠定了基础。
研究结论：在健康雄性和雌性大鼠中，group IV肌肉传入神经的胞体能够合成μOR、δOR和κOR，但只有μOR被高效转运至外周轴突，而δOR和κOR的轴突表达极低。这种差异性的轴突定位模式解释了μOR激动剂对group IV介导的运动加压反射和肌肉疼痛的选择性抑制效应，并且该表达模式不存在显著的性别差异。
