《Frontiers in Toxicology》：Leveraging the developmental neurotoxicity in vitro battery: lessons learned interpreting assay outputs and integrating human exposure
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发育中的大脑由于神经发育过程的复杂性和精确时序而对化学物质暴露高度敏感。针对关键神经发育事件的体外检测可揭示发育神经毒性（developmental neurotoxicity, DNT）通路，并代表了替代检测策略的重要进展。经济合作与发展组织（Organis
发育中的大脑由于神经发育过程的复杂性和精确时序而对化学物质暴露高度敏感。针对关键神经发育事件的体外检测可揭示发育神经毒性（developmental neurotoxicity, DNT）通路，并代表了替代检测策略的重要进展。经济合作与发展组织（Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD）发布了关于设计和评估用于筛选化学物质对神经发育影响的DNT体外测试组合（DNT in vitro battery, DNT IVB）的初步建议。迄今为止，由于检测性能、结果解读及生物活性情境化方面的不确定性，该新型测试组合的监管应用尚未得到表征。为积累评估DNT IVB检测性能和结果解读的经验，研究人员使用一组具有代表性的商业化检测，评估了八种天然化合物，每种化合物均有确定的膳食背景暴露，且在“正常”膳食摄入下无假定DNT风险：EGCG、叶酸、香兰素、柠檬烯、维生素E、姜黄素、金雀异黄酮和咖啡因。在所检测的化合物中，有四种被发现具有“特异性阳性结果（specific hits）”，包括EGCG、金雀异黄酮、咖啡因和姜黄素。将出现体外特异性阳性结果的浓度与已发表的人体血浆水平进行比较，发现EGCG的体外生物活性浓度处于相关人体暴露水平范围内。相反，对于姜黄素、金雀异黄酮和咖啡因，在评估的DNT IVB检测中发现的任何特异性阳性结果均出现在高于已报道人体血浆水平的浓度，表明其与人类风险评估的相关性有限。此外，研究人员的这项研究强调，需要定义明确的性能标准、可重复的参考对照、标准化的阳性结果判定方法、基准反应确定以及跨测试组合的解读，以确保可靠性和可重复性，从而为监管接受做好准备。总体而言，虽然DNT IVB为改进化学品安全评估的筛选应用提供了有价值的见解和机会，但其有效使用需要加强关于检测性能、数据解读以及暴露评估整合的指导，以支持其在人类健康风险评估中的稳健应用。
发育神经毒性（developmental neurotoxicity, DNT）是指从宫内暴露至青少年早期对发育中大脑和神经系统产生的不良效应。由于神经发育过程复杂且时序精确，发育期大脑对外源化学物高度敏感。在现行监管框架中，DNT测试并非普遍强制，且不同地区要求不一。传统体内DNT测试指南（如OECD TG 426）主要评估组织病理、运动感觉功能和认知等顶端终点，但存在人相关性不足、伦理负担和通量低等局限。为此，新方法（new approach methodologies, NAMs）快速发展，其中经济合作与发展组织（OECD）于2023年发布了发育神经毒性体外测试组合（DNT in vitro battery, DNT IVB）的初步建议，该组合包含17种体外检测，覆盖8个关键神经发育过程（key neurodevelopmental processes, KNDPs）：神经祖细胞增殖与凋亡、细胞迁移、神经元和少突胶质细胞分化、神经突生长、神经元成熟与突触发生以及神经网络形成。然而，该测试组合在监管应用中的性能、结果解读和生物活性情境化仍存在不确定性。为获得实际应用经验，研究人员选取8种具有明确膳食背景暴露且“正常”摄入下无假定DNT风险的天然化合物进行测试，并系统比较体外生物活性浓度与人体内暴露水平。
研究人员采用DNT IVB的代表性子集，包括神经球检测（NPC1-5）和人神经网络形成（human neural network formation, hNNF）检测，对上述8种化合物进行浓度-反应分析。结果显示，在8种化合物中，仅有4种出现“特异性阳性结果”，即EGCG、金雀异黄酮、咖啡因和姜黄素。通过将体外基准浓度（benchmark concentration, BMC）与已发表的人体血浆浓度比较，发现EGCG的体外生物活性浓度处于相关人体暴露水平范围内；而姜黄素、金雀异黄酮和咖啡因的特异性阳性结果仅出现在高于人体血浆浓度的水平，提示对常规饮食暴露下的人类风险评估意义有限。研究还计算了暴露边界（margin of exposure, MOE），其变动范围很大，进一步说明将暴露信息纳入解读的重要性。该研究的意义在于首次系统评估了DNT IVB在实际化学品评价中遇到的性能变异性、阳性判定和暴露整合问题，为后续制定性能标准和解读指南提供了依据。
在技术方法上，研究人员使用了原代人神经祖细胞（human neural progenitor cells, hNPCs）神经球模型和由谷氨酸能、GABA能诱导神经元与星形胶质细胞共培养的hNNF模型（细胞来源分别为Lonza Verviers SPRL和NeuCyte）。神经球检测包括NPC1增殖（BrdU ELISA）、NPC2迁移（图像分析）、NPC3/5分化（高内涵成像）和NPC4神经突形态（Omnisphero分析）；hNNF利用微电极阵列（microelectrode array, MEA）记录自发电活动并提取14个网络参数。所有数据基于浓度-响应模型分析，采用R包CRStats计算BMC和基准反应（benchmark response, BMR），并按分类模型将每个终点判定为特异性、临界、非特异性或无阳性。
**天然化合物文献综述**：研究人员系统检索文献并整合国际监管机构的评估，获取了各化合物的人体暴露水平、药代动力学参数和纯度信息。这些信息为确定测试浓度范围和后续MOE计算提供了基础。
**DNT IVB检测性能**：研究人员先审查终点特异性阳性对照（endpoint specific positive controls, ESPCs）的数据和重复一致性。发现并非所有ESPC都能稳定产生预期的响应，某些对照在多次实验间变异很大，且部分测试化合物也呈现类似的高变异性，表明需明确性能标准和验收标准以保障数据的可靠性和可重复性。
**DNT IVB天然化合物检测**：在预实验确认无细胞毒性的基础上
