副干酪乳杆菌VCare-360对小鼠外阴阴道念珠菌病的抑制作用研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Inhibitory effect of Lacticaseibacillus paracasei VCare-360 on Candida albicans in mice with vaginal candidiasis

　　

背景： 外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VC）主要由念珠菌（Candida）属引起，是全球最常见的生殖道感染之一。抗生素和抗真菌药物的过度使用加剧了真菌耐药性，因此探索新的替代疗法迫在眉睫。本研究旨在探讨副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）VCare-360的抗白色念珠菌（Candida albicans）活性。 方法： 研究人员检测了该菌株体外产生过氧化氢和乳酸的能力及其抗真菌活性。采用阴道上皮细胞模型评估细菌竞争性黏附及对促炎细胞因子分泌的调节作用。构建小鼠外阴阴道念珠菌病动物模型，评估益生菌干预后阴道黏膜修复、炎症因子水平、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性以及阴道和粪便微生物群组成的变化。 结果： 副干酪乳杆菌VCare-360与白色念珠菌竞争阴道上皮细胞黏附位点，抑制真菌定植，并在体外降低促炎细胞因子的释放。在小鼠模型中，该益生菌减轻了阴道上皮脱落，修复受损的阴道黏膜并缓解局部炎症（p < 0.05）。同时，研究人员观察到血液和阴道组织中促炎细胞因子浓度及髓过氧化物酶活性降低。测序结果显示，VCare-360富集了乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度，并减少了阴道中埃希菌-志贺菌属（Escherichia-Shigella）的丰度。 结论： 副干酪乳杆菌VCare-360能够抑制白色念珠菌感染、调节阴道菌群并恢复阴道黏膜屏障，是治疗念珠菌所致外阴阴道念珠菌病的一种有前景的益生菌候选菌株。

论文解读：副干酪乳杆菌VCare-360治疗外阴阴道念珠菌病的潜力

一、研究背景与意义

外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是仅次于细菌性阴道病的第二大常见阴道感染，主要由机会性真菌白色念珠菌（Candida albicans）引起，约75%的女性一生中至少感染一次。目前氟康唑是治疗VVC的一线抗真菌药物，临床研究显示约96%的患者症状得到缓解，但高达63%的患者在维持治疗后仍出现持续或复发性症状。高复发率不仅给患者带来持续不适和心理困扰，也对临床管理构成挑战，凸显了现有抗真菌策略长期疗效的局限性和探索替代或辅助疗法的必要性。

健康阴道生态系统中，乳杆菌属（Lactobacillus）构成优势菌群，通过产生乳酸、过氧化氢、细菌素和生物表面活性剂等代谢产物发挥保护作用。越来越多的证据表明，益生菌乳杆菌作为VVC的补充或预防干预手段，在调节阴道微生物群和减少症状复发方面显示出良好效果。已有研究报道多种乳杆菌菌株（如L. gasseri VHProbi E09、L. fermentum KBL674等）对白色念珠菌具有抑制作用。此外，肠道-阴道轴（gut-vagina axis）的概念日益受到重视，乳杆菌反应性免疫细胞可从肠道迁移至阴道，促进特异性或交叉反应性抗体的产生，凸显了黏膜免疫系统介导的系统性协同防御机制。

本研究旨在评估副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）VCare-360在人阴道上皮细胞（VK2/E6E7）中的抗念珠菌活性，及其在白色念珠菌诱导的小鼠外阴阴道念珠菌病模型中的治疗潜力，为益生菌缓解VVC提供证据支持。

二、主要技术方法

研究人员从某酒厂的糖化样品中分离获得副干酪乳杆菌VCare-360（CGMCC 31095）及其他副干酪乳杆菌菌株，阳性对照菌株（PS）来源于市售女性健康益生菌产品（科汉森中国有限公司），白色念珠菌ATCC10231和CICC1965购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。主要技术方法包括：定量测定菌株过氧化氢和乳酸产量；通过96孔板法测定发酵上清液对白色念珠菌的抑制率和半数抑制浓度（IC₅₀）；利用人阴道上皮细胞系VK2/E6E7（ATCC CRL-2616）进行黏附实验和竞争黏附实验；通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测促炎细胞因子（TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β）的mRNA表达水平；构建BALB/c小鼠外阴阴道念珠菌病模型，进行阴道上皮脱落检测、组织病理学分析（苏木精-伊红染色，H&E染色）、酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清和阴道组织中细胞因子及髓过氧化物酶（MPO）水平；通过16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序分析阴道和粪便微生物群落结构。

三、研究结果

3.1 过氧化氢、乳酸产量及抑制活性

研究人员检测了4株副干酪乳杆菌的体外代谢物产量，其中VCare-360表现出较高的过氧化氢（4.98 mg/L）和乳酸（18.75 g/L）产量。对不同浓度VCare-360发酵上清液进行抗白色念珠菌活性评估，结果显示其对真菌生长的抑制率达99.69%，对白色念珠菌ATCC10231和CICC1965的IC₅₀值分别为0.51和0.54，优于阳性对照菌株（IC₅₀分别为0.69和0.70），表明VCare-360具有优异的抗白色念珠菌潜力。

3.2 黏附实验及乳杆菌对病原体黏附的影响

黏附是阴道乳杆菌发挥有益作用的关键，也是白色念珠菌等病原体的重要毒力因子。VCare-360对VK2/E6E7细胞的黏附能力显著优于PS菌株，黏附指数分别为19.85±5.85 CFU/细胞和8.25±3.16 CFU/细胞（p < 0.0001）。在竞争黏附实验中，对照组白色念珠菌黏附指数为41.75±13.14 CFU/细胞，与PS共培养后显著降至13.45±3.71 CFU/细胞，而VCare-360将其进一步降至10.95±4.46 CFU/细胞（p < 0.0001），显示出更强的竞争性排斥作用。

3.3 VK2/E6E7细胞炎症基因表达响应

白色念珠菌感染显著上调VK2/E6E7细胞中促炎细胞因子基因TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA表达。阳性益生菌和VCare-360均表现出优于对照的抗炎效果，细胞因子表达显著降低（p < 0.05），且VCare-360组在实验重复中结果更稳定、更可重复。

3.4 小鼠体重变化

双因素方差分析显示时间与处理组之间存在显著交互作用（p < 0.0001）。所有感染组在感染后均出现短暂体重下降，模型组在第3天达到最低点（17.99±0.90 g），显著低于对照组（20.34±0.60 g）。VCare-360干预缓解了体重下降趋势，治疗组在整个干预期间体重逐渐恢复，低剂量组终点平均体重达19.75±1.10 g，表明VCare-360有助于缓解白色念珠菌感染引起的生理应激。

3.5 VCare-360在小鼠体内的定植

通过qPCR检测第17天阴道灌洗液中副干酪乳杆菌的载量，干预前未检测到副干酪乳杆菌，干预后在阴道中检测到VCare-360定植，提示其存在可能对白色念珠菌的体内生长发挥抑制作用。

3.6 阴道上皮脱落的影响

真菌性阴道炎的关键临床特征之一是阴道上皮完整性破坏，表现为上皮细胞脱落增加。模型组每视野约50.7个脱落细胞，对照组为17.0个。高剂量VCare-360显著减轻了上皮脱落（p < 0.05），竞争组也显著缓解（p < 0.01），表明VCare-360能有效防止病原体在组织中的扩散和黏附。

3.7 阴道组织病理学分析

对照组阴道上皮光滑连续、组织结构完整、无炎症浸润。模型组表现为黏膜上皮不连续、浅表糜烂和微缺损，伴黏膜内大量局部炎症细胞浸润。益生菌干预显著缓解了这些症状，VCare-360低剂量和高剂量组均表现出明显的阴道结构恢复，上皮细胞紧密排列、核均匀、嗜酸性染色一致，基质水肿减轻、无明显纤维增生，表明VCare-360有效促进黏膜恢复并缓解炎症。

3.8 细胞因子和髓过氧化物酶表达

血清检测显示，与模型组相比，VCare-360干预显著促进抗炎反应：所有治疗组IL-10水平显著升高（p < 0.01），PS和VCare-360高剂量组IL-4水平显著增加（p < 0.05或p < 0.01）。高剂量VCare-360和PS显著降低TNF-α、IL-6和MPO水平（TNF-α和MPO的p < 0.0001，IL-6的p < 0.001）。阴道组织检测结果与血清学发现一致，VCare-360（低和高剂量）及PS显著增加IL-10水平（p < 0.05或p < 0.01），PS和VCare-360高剂量组IL-4表达显著上调，所有干预组TNF-α水平显著下调，高剂量VCare-360显著降低IL-6水平和MPO活性，表明VCare-360通过将局部细胞因子环境转向抗炎状态并抑制中性粒细胞募集来缓解阴道炎症。

3.9 阴道和粪便微生物群

白色念珠菌感染显著改变了模型组阴道微生态：物种丰富度（Chao指数）显著降低（p < 0.01），Simpson和Shannon指数显著升高（均p < 0.001），提示优势有益菌群丧失和病原体过度生长导致的群落均匀度增加。益生菌干预后，失调趋势得到缓解，高剂量组Chao指数呈部分恢复。PCoA分析显示模型组与对照组沿PC1轴显著分离（PERMANOVA：R = 0.1384，p = 0.008），VCare-360组（尤其高剂量组）呈现远离模型组、接近对照组或PS组的趋势。LEfSe分析显示，模型组阴道中机会性病原菌埃希菌-志贺菌属（Escherichia-Shigella）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）显著富集，对照组富集Muribaculaceae。粪便微生物群分析显示，模型组较对照组Firmicutes丰度降低、Bacteroidota丰度增加，益生菌干预有效逆转了这一趋势，治疗组乳杆菌属丰度显著恢复（VCare-360低剂量组：20.34%；PS组：20.77%，模型组为10.23%）。肠道微生物健康指数（GMHI）在模型组显著降低（p < 0.01），微生物失调指数（MDI）显著升高（p < 0.01），VCare-360低和高剂量均显著提高GMHI（p < 0.05）并显著降低MDI（p < 0.01），表明VCare-360有助于恢复肠道微生物平衡。

四、讨论与结论

研究人员在讨论中指出，维持阴道微生物平衡是预防女性生殖疾病的关键。VCare-360具备缓解VVC的一系列特性：体外实验证实该菌株产生过氧化氢、乳酸和抗微生物肽等关键抗真菌代谢物，对白色念珠菌具有强抑制效果。该菌株对阴道上皮的黏附有助于形成保护性生物膜，防止病原体在黏膜表面定植。VCare-360的安全性已通过初步测试验证，包括溶血活性检测、抗生素敏感性分析和体内致病性评估，21天观察期内未观察到异常临床体征、体重下降或死亡，符合益生菌菌株的安全标准。口服益生菌可通过肠道-阴道轴迁移至阴道等定植位点发挥临床效应。研究证实VCare-360在口服给药后成功定植于小鼠阴道，并通过竞争性黏附减轻外阴阴道念珠菌病。该菌株通过调节抗炎细胞因子（IL-10、IL-4）和促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平抑制炎症，降低MPO表达，减轻有害炎症反应。VCare-360干预还增加了阴道和粪便中乳杆菌属的相对丰度，调节肠道微生物平衡。研究人员也承认研究存在局限性，包括人阴道上皮细胞系和小鼠模型与人体复杂生理环境的差异，未来需开展随机对照临床试验以全面评估VCare-360在VVC女性患者中的最佳剂量和治疗效果。

结论： 研究结果表明，副干酪乳杆菌VCare-360对外阴阴道念珠菌病具有治疗潜力。该菌株在体外显著抑制白色念珠菌，在细胞炎症模型中抑制白色念珠菌黏附并下调促炎细胞因子，成功定植于小鼠阴道组织，同时降低阴道组织和血液中促炎细胞因子水平，调节阴道和粪便微生物群以恢复健康状态。综合这些结果支持口服副干酪乳杆菌VCare-360改善VVC的潜力。