三价胃癌抗原偶联白喉毒素表位联合NKT细胞激动剂增强抗肿瘤免疫

《Frontiers in Immunology》：A trivalent gastric cancer antigen conjugated to a diphtheria toxin epitope synergizes with an NKT cell agonist to boost antitumor immunity

　　

摘要：胃癌相关抗原MG7-Ag在多种消化道恶性肿瘤中异常表达，是开发泛消化道肿瘤肽类疫苗的理想广谱靶点，但其临床应用受限于低免疫原性。为克服这一限制，研究人员将白喉毒素衍生的T辅助表位共价偶联至三价抗原MG3（由单价MG1肽段串联重复构建）。随后通过将DT-MG3与自然杀伤T（NKT）细胞激动剂α-半乳糖神经酰胺（αGalCer）共同包载，制备了脂质体疫苗。免疫学评估显示，DT-MG3联合αGalCer诱导的特异性IgG滴度显著高于单独DT-MG3或未偶联的MG3/αGalCer组合。该疫苗还促进了IFN-γ/IL-4分泌，增强了CD4+/CD8+ T细胞应答，从而提升了抗原免疫原性。此外，该疫苗诱导的高滴度特异性抗体能有效结合EAC肿瘤细胞并引发补体依赖性细胞毒性（CDC）。在EAC腹水模型中，DT-MG3/αGalCer疫苗接种显著减少了恶性腹水积聚并延长了荷瘤小鼠的生存期。总之，这种基于白喉毒素表位共价偶联三价MG3抗原的新型抗胃癌疫苗，为合理设计强效且安全的全合成肽类抗肿瘤疫苗提供了重要见解。

研究背景与目的

胃癌是全球第五大高发恶性肿瘤，死亡率极高，严重威胁人类健康。尽管以手术切除联合化疗、靶向治疗和免疫治疗为核心的综合治疗方案已经建立，但晚期胃癌患者仍面临有效干预手段有限、预后极差的问题。因此，亟需开发靶向效率更高、生物安全性更好的新型治疗策略。肿瘤疫苗旨在诱导持久的免疫记忆，在主动治疗结束后仍可持续维持抗肿瘤免疫应答，有望提供长期保护以防止肿瘤复发，已被公认为晚期胃癌精准治疗的关键方向之一。然而，高效胃癌疫苗的开发一直受到理想肿瘤相关抗原匮乏的制约。单克隆胃癌7抗原（MG7-Ag）是一种胃癌相关肿瘤抗原，在胃癌组织中高表达，其表达与肿瘤侵袭、转移和预后密切相关，因此是疫苗设计的理想靶点。此外，MG7-Ag在结直肠癌、食管癌等多种消化道恶性肿瘤中也存在异常表达，表明它是开发泛消化道肿瘤肽类疫苗的广谱抗原。但MG7-Ag免疫原性弱是其用于疫苗开发的主要障碍，具体而言，单价MG7-Ag肽疫苗对发挥抗肿瘤效应至关重要的细胞免疫激活作用有限，且天然MG7-Ag表位的抗原呈递效率较低，难以被树突状细胞（DC）有效识别并提呈给T细胞，从而阻碍有效免疫应答的启动。相比之下，多价疫苗能诱导比单价疫苗更强的抗肿瘤效应。因此，通过抗原肽的共价串联重复实现抗原簇集，对于达到最佳免疫效果至关重要。基于蛋白质来源的T细胞表位肽构建的全合成疫苗具有高生物安全性，能有效激活T细胞并避免过度免疫原性。白喉类毒素（DT）及其无毒交叉反应物质CRM197是临床批准的载体蛋白，广泛应用于针对病原体的许可结合疫苗。这些载体蛋白衍生的T辅助表位可用于肽疫苗设计，提供CD4⁺ T细胞帮助，这对抗原特异性B细胞和CD8⁺ T细胞的活化与分化至关重要。佐剂被认为是抗肿瘤肽疫苗的关键组分，其增强免疫原性的作用是通过激活先天免疫细胞、调节免疫微环境和提高抗原呈递效率来实现的。α-半乳糖神经酰胺（αGalCer，也称KRN7000）是一种合成的鞘糖脂类NKT细胞激动剂，能以CD1d限制性方式被提呈给NKT细胞，快速激活NKT细胞并分泌IL-4和IFN-γ等多种细胞因子，在有效桥接先天性和适应性免疫中发挥重要作用。基于上述进展，研究人员构建了一种胃癌疫苗，将白喉毒素衍生的T辅助表位DT_331-345共价偶联至三价MG3抗原，并加入NKT细胞激动剂αGalCer作为佐剂。本研究旨在阐明DT表位与αGalCer佐剂协同增强基于MG1抗原的疫苗免疫原性的机制，为开发靶向胃癌的肽类抗肿瘤疫苗提供实验证据和新策略。

主要关键技术方法

研究人员采用固相肽合成法合成了所有肽段，包括单价MG1抗原、三价MG3抗原以及DT-MG1和DT-MG3偶联物。利用薄层分散法制备了脂质体疫苗，固定了抗原/佐剂/DSPC/胆固醇的摩尔比。选用SPF级雌性BALB/c小鼠进行免疫，在第1、15、29天腹腔注射候选疫苗，并在指定时间点收集血清和脾细胞。采用酶联免疫吸附试验检测细胞因子水平和抗体滴度及亚型，流式细胞术分析抗体与EAC肿瘤细胞的结合能力以及胞内细胞因子染色评估T细胞应答，MTT法测定补体依赖性细胞毒性，乳酸脱氢酶释放法进行离体脾细胞细胞毒性测定。在EAC腹水肿瘤模型中评估体内抗肿瘤疗效，并通过生化指标分析和组织病理学检查评价生物安全性。

研究结果

3.1 脂质体疫苗的表征

通过动态光散射和Zeta电位分析表征脂质体制剂的理化性质。结果显示，含DT-MG3的脂质体平均粒径约为300 nm，而不含DT表位的MG3脂质体平均直径较小，约为150 nm。所有组别脂质体均带负电荷，Zeta电位范围为-15 mV至-30 mV。

3.2 白喉类毒素表位和NKT细胞激动剂协同增强特异性免疫

为探究疫苗诱导的免疫应答极化状态和强度，研究人员评估了初次免疫后2小时和24小时小鼠血清中Th2型细胞因子IL-4和Th1型细胞因子IFN-γ的分泌水平。结果表明，含有αGalCer的疫苗促进了IL-4和IFN-γ的分泌，其中DT-MG1+αGalCer组诱导的细胞因子分泌水平最为突出，是MG1+αGalCer组的两倍以上，表明白喉毒素表位与NKT细胞激活在调控先天免疫方面发挥了协同效应。进一步研究发现，DT-MG3+αGalCer组诱导的抗MG1 IgG滴度最高，是单纯DT-MG3组的2倍，是MG3+αGalCer组的10倍，且显著高于DT-MG1+αGalCer组，证实了三价MG3抗原的多价效应显著增强了MG1特异性IgG的产生。IgG亚型分析显示，大多数组别中以IgG1为主导亚型，而DT-MG3+αGalCer组不仅提高了IgG1水平，还促进了MG1特异性IgG2a、IgG2b和IgG3的分泌，表明该疫苗配方诱导了广泛多样的抗体谱。流式细胞术分析显示，DT-MG3+αGalCer组血清与EAC肿瘤细胞的抗体结合率（66.2%）显著高于DT-MG3组（51.6%）和MG3+αGalCer组（39.7%），且该结合具有抗原特异性，因为对MG7-Ag阴性的B16-F10细胞无显著结合。MTT法检测补体依赖性细胞毒性结果显示，DT-MG3+αGalCer组免疫血清使EAC细胞存活率降至约33%，远低于DT-MG3组的49%和MG3+αGalCer组的79%。离体脾细胞细胞毒性实验表明，DT-MG3+αGalCer联合免疫组的脾细胞对EAC细胞的杀伤率显著高于其他实验组。

3.3 DT-MG3+αGalCer疫苗增强抗原特异性细胞免疫

为探索疫苗诱导的抗原特异性细胞免疫应答，研究人员在末次免疫后第14天分离脾细胞进行胞内细胞因子染色。结果显示，DT-MG3+αGalCer组诱导了最高比例的IFN-γ⁺TNF-α⁺双阳性CD4⁺ T细胞（4.24%），高于DT-MG3组的1.97%；在CD8⁺ T细胞中也观察到类似趋势，DT-MG3+αGalCer组诱导了最高比例的双阳性细胞。这些发现表明白喉毒素衍生的T细胞表位与NKT细胞激动剂αGalCer协同增强了抗原特异性细胞免疫应答。

3.4 DT-MG3+αGalCer疫苗诱导强效抗肿瘤免疫

在EAC腹水肿瘤模型中，DT-MG3+αGalCer疫苗显著延长了腹水荷瘤小鼠的生存期，体重减轻和腹水积聚均得到明显缓解，表明该候选疫苗有效抑制了腹水肿瘤进展。相比之下，单独DT-MG3或MG3+αGalCer治疗仅表现出中等的抗肿瘤效果，明显弱于DT-MG3+αGalCer疫苗组。这些结果表明白喉毒素衍生的Th表位与NKT细胞激动剂αGalCer能在体内协同增强抗肿瘤免疫应答。

3.5 候选疫苗的生物安全性评估

为评估候选疫苗的生物安全性，研究人员在免疫方案完成后第42天测量了小鼠血清肝肾功能参数。结果显示，所有疫苗组的丙氨酸氨基转移酶、尿素和肌酐值与PBS组相比仅有轻微差异，未观察到明显的肝肾功能异常。同时，对心、肝、脾、肺、肾和脑等主要器官的组织病理学检查也未发现明显的炎性浸润或其他病理改变，为疫苗的安全性提供了初步证据。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究中构建的多组分脂质体疫苗通过三价肿瘤抗原MG3、白喉毒素衍生的T辅助表位和NKT细胞激动剂αGalCer的组合，成功诱导了强大而广泛的抗肿瘤免疫应答，在高度侵袭性的小鼠腹水肿瘤模型中显著抑制了肿瘤进展并延长了生存期。DT-MG3与αGalCer联用获得的优越免疫效力可能源于适应性辅助T细胞启动与先天性NKT细胞激活之间的协同作用。多价MG3抗原设计可能克服了单体MG1肽免疫原性差的局限性，而共价连接的DT表位进一步补充了持久体液应答所必需的CD4⁺辅助信号。αGalCer作为连接先天性和适应性免疫的关键介质，能快速激活NKT细胞并大量产生免疫调节细胞因子。除了体液免疫外，DT-MG3+αGalCer疫苗还诱导了最高频率的功能性IFN-γ⁺TNF-α⁺双阳性CD4⁺和CD8⁺ T细胞，发挥强大的肿瘤杀伤作用。在EAC腹水肿瘤模型中，联合疫苗组显著抑制了恶性腹水并延长了动物生存期。此外，优化的脂质体递送系统在所用免疫剂量下保证了良好的体内生物安全性。结论部分翻译如下：

为提高胃癌相关抗原MG1的免疫原性，本研究成功构建了一种新型脂质体抗胃癌疫苗，包含三价MG3抗原、白喉毒素衍生的Th表位和αGalCer。共价偶联的DT表位提供了充足的CD4⁺ T细胞帮助，显著增强了抗原特异性IgG的产生。αGalCer进一步调节了先天性和适应性免疫之间的交互作用，从而促进抗体亚型转换并加强补体依赖性肿瘤杀伤。此外，联合疫苗触发了强效的细胞免疫应答，功能性IFN-γ⁺TNF-α⁺双阳性T细胞频率显著升高，发挥强大的肿瘤杀伤效应。基于EAC恶性腹水模型的体内评估表明，该疫苗显著抑制了腹水积聚，明显延长了荷瘤小鼠的生存期，且无明显全身毒性。总之，该脂质体疫苗平台代表了晚期胃癌临床免疫治疗应用的一个有前景的候选方案。